プロテアーゼ生産性Bacillus 属細菌の16S rDNAの制限酵素切断部位に基づく同定

[要　約]

　ユニバーサルプライマーで増幅した16S rDNAの制限酵素切断部位（Hae III ，Cfo I ，Alu I ）の相違により，耕地土壌から 分離したプロテアーゼ生産性のBacillus 細菌は種或いは近縁種のレベルで同定できる。

九州農業試験場　生産環境部　土壌微生物研究室
[部会名]　農業生態
[専　門]　土壌
[対　象]　　
[分　類]　研究

[背景・ねらい]

　現在まで土壌の物質循環と微生物生態との関係解明を目的として，土壌プロテアーゼの生産に重要な役割を果たす多数のBacillus 属細菌を 分離してきている。近年Bacillus 属細菌の分類は16S rDNAの可変領域の塩基配列により見直されてきている。よって，この領域の相違を反映する 制限酵素切断部位を検索し，これらの制限酵素切断部位の相違に基づいたプロテアーゼ生産性のBacillus 属細菌の同定手法を開発する。

[成果の内容・特徴]

1. データベースに登録されている16S rDNAの塩基配列から推定したBacillus属細菌（19種；31株）は制限酵素切断部位（HaeIII ，CfoI ， AluI ）の相違により，16グループに分類できる（図１）。
2. ユニバーサルプライマーを用いて増幅した対照菌株（９株）と，水田土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus 属細菌（12株）の16S rDNA （22-1085bp）を，制限酵素で切断し，デンシトグラムで求めた断片長をもとに推定した切断部位は，データベースから推定した切断部位とほぼ一致した （表１)。そこでこの手法は同定手法として利用できる。
3. この手法によって新たに畑土壌から分離したプロテアーゼ生産性のBacillus属細菌（11株）は制限酵素切断部位から，B. subtilis グループ（U80：�A*）， B. cereus グループ（N4，N3，N7，N9，N68，U44，U72：�H，�H**），B. sphaericus （N63，N80，U77：�M***）と同定され （表１)，結果は簡単な生理試験による結果と一致した。

   　以上の結果から16S rDNAの制限酵素切断パターンによる分類はBacillus 属細菌の簡易な同定手法として有効である。

[成果の活用面・留意点]

1. 土壌から分離したBacillus 属細菌のみではなく，形態学的グループ１群及び３群に属する一般的なBacillus 属細菌の分類／同定にも適用できる。
2. 類縁種であるB. subtilis グループ，B. cereus グループ内の分類は本法ではできない。
3. デンシトグラムで求めた切断長から推定した切断部位はデータベースから決定した切断部位と１，２箇所のAlu I 部位の違いが見られる場合がある。

[その他]
研究課題名：バイオマス窒素の代謝関連微生物活性の動態
予算区分　：一般別枠（物質循環）
研究期間　：平成９年度（平成４〜10年）
発表論文等：16S rDNAの制限酵素切断パターンによるBacillus属細菌の分類と同定，第11回日本
　　　　　　微生物生態学会講演要旨集 (1995)