PCR-DGGE法による土壌中のクロロ安息香酸分解菌群の検出

［要　約］: 　PCR-DGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法によって，土壌から直接クロロ安息香酸分解遺伝子を検出できる。この方法により，培養法では見落とされていた土壌中のクロロ安息香酸分解菌を効率的に探索できる。

[担当研究単位]　農業環境技術研究所　化学環境部　有機化学物質研究グループ　土壌微生物利用ユニット
[分　類]　学術

［背景・ねらい］: 　クロロ安息香酸を分解できる微生物は，PCB等の難分解性芳香族塩素化合物による汚染環境の浄化に有用である。従来，このような分解菌を土壌から取得するためには，主に液体集積培養などの培養手法が用いられてきた。しかし，集積培養で得られる分解菌は，培地中の特殊な条件下で選抜されたものであるために，実際の土壌環境中での分解能や定着性が優れているとは限らない。さらに，土壌中の微生物の大半は培養困難なものであることが知られており，培養手法で見出せる分解菌はごく一部に過ぎないと考えられる。そこで，培養法に頼らず，土壌中のクロロ安息香酸分解菌群を直接検出することを目指し，分解遺伝子を標的としたPCR-DGGE法の利用を試みる。

［成果の内容・特徴］

クロロ安息香酸分解反応の重要なステップを担う酵素，安息香酸ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（以下benA）を，土壌中の多様な細菌種から増幅できるプライマーを作製した。このプライマーを用いてPCR-DGGEを行なう。
3-クロロ安息香酸（以下3CB）を添加した土壌及び液体集積培養から経時的にDNAを抽出し，PCR-DGGEを行なった（図１）。土壌DNAから得られたDGGEパターンは，多数のバンドで構成されており，これは多様なbenA保有細菌が土壌中に存在していることを意味する。一方，集積培養のパターンは，少数のバンドからなる単純なものであり，ごく一部の菌のみが選択的に培養されていることを示している。この結果から，土壌DNAをもとにしたPCR-DGGEによって，集積培養法では見落とされていた分解菌を検出できることが確認される。
3CBの添加後，新たに出現するバンドは3CBを分解資化することによって増殖した菌に由来すると考えられる。土壌中と集積培養中では，3CBの添加によって増強するバンド（図１；A，B）に違いがみられ，それぞれの条件に適した異なる分解菌が優勢化していることが分かる。
3CB添加土壌から得られたDGGEパターンから，主要なバンドを切り出して塩基配列を決定し系統樹を作製した（図２）。この結果，本手法によって多様なbenA遺伝子が網羅的に検出されていることが分かる。また，3CBの添加によって新たに出現したバンド（a，e）は，Burkholderia属細菌がもつbenAに近縁な配列であることから，土壌中での3CB分解にはこのグループの分解菌群が関与している可能性が高い。

［成果の活用面・留意点］

3CB添加土壌において増強するDGGEバンドと同じ塩基配列を持つ菌を選抜することによって，土壌環境に適した分解菌を効率的に探索できる。
標的とする遺伝子を変えることによって，クロロ安息香酸以外の物質の分解に関わる微生物についても同様のアプローチが可能である。

[その他]
 研究課題名 ： クロロ安息香酸分解菌等の分解遺伝子群の構造と機能の解析技術の開発
　　　　　　　 （クロロ安息香酸分解菌等の分解能解析技術の開発）
 予算区分　 ： 運営費交付金
 研究期間　 ： 2003年度（2001～2005年度）
 研究担当者 ： 森本　晶，小川直人，長谷部亮，藤井　毅
 発表論文等 ： 1）森本ら，第18回日本微生物生態学会講演要旨集，62（2002）
               2）森本ら，日本農芸化学会2003年度大会講演要旨集，235（2003）

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