動物衛生研究部門

家畜における生化学病性鑑定のための臨床生化学的検査マニュアル

II.原子吸光法による臓器中 銅,亜鉛の測定

測定原理

生体材料である肝臓や腎臓内の金属を測定するためには試料に強酸を加え加熱灰化する。その後灰化液を適当な濃度に希釈し、原子吸光分光光度計で測定する。

参考文献

  • 衛生試験法・注解:日本薬学会編, 1990 金原出版
  • 栄養診断のための栽培植物分析測定法:作物分析法委員会編, 1976 養賢堂

目次

1.準備物

(1)器具

  • 原子吸光分光光度計(フレーム型)
  • ケルダール分解装置
  • ケルダールフラスコ (30 ml容)
  • 蒸発皿 (外径60 mm、平底) るつぼでも可
  • 試験管バサミ、るつぼバサミ
    ガラス器具は酸洗浄済みのもの
    -酸洗浄-
    通常の洗浄は、1%硝酸に一晩浸けて乾燥させる。

原子吸光分光光度計(定量演算機能付き)
原子吸光分光光度計原子吸光分光光度計

ケルダール分解装置(水流ポンプ付き)
ケルダール分解装置ケルダール分解装置

ケルダールフラスコ(30ml容)、蒸発皿、試験管バサミ、るつぼバサミ
ケルダールフラスコ(30ml容),蒸発皿 試験管バサミ,るつぼバサミ

(2)試薬

  • 硝酸 (精密分析用)
  • 硫酸 (精密分析用)
  • 過塩素酸 (精密分析用)
  • 塩酸 (精密分析用)
  • 銅、亜鉛標準液 (原子吸光分析用)

2.試薬調製法 (原子吸光法による飼料中 銅、亜鉛の測定と同様)

(1)標準液

銅、亜鉛二種混合高濃度標準液
メスフラスコに銅標準液 1.0 ml、亜鉛標準液 0.5 mlを入れ、1N 塩酸を加え全量を100 mlにする(表-1)

(表-1)

市販品 標準液 1N塩酸 濃度
銅標準液
(1000 mg/L)
1.0 ml 全量を100 mlにする 銅濃度は1,000 μg/dl
亜鉛濃度は500 μg/dl
亜鉛標準液
(1000 mg/L)
0.5 ml

 

銅、亜鉛二種混合測定用標準液
高濃度標準液を所定量取り、1N 塩酸で全量を10 mlにする(表-2)

(表-2)

標準液 高濃度標準液
(ml)
1N塩酸
(ml)
全量
(ml)
最終銅濃度
(μg/dl)
最終亜鉛濃度
(μg/dl)
Blank 0.00 10.0 10.0 0 0.0
Std 1 0.25 9.75 10.0 25 12.5
Std 2 0.50 9.50 10.0 50 25.0
Std 3 1.00 9.00 10.0 100 50.0
Std 4 2.00 8.00 10.0 200 100.0

(2)試薬

  • 過塩素酸:硫酸(4:1)混液
    作製する混合液の倍以上のビーカーに、過塩素酸を静かに入れる。
    次いで、ガラス棒を伝わせ硫酸を少量ずつ加える
    100 mlの混合液を作る場合は200~300 mlのビーカーを使用
    混合液は発熱するので注意
  • 1N 塩酸および6N 塩酸
    濃塩酸を蒸留水で12倍および2倍する
    酸塩基試薬の調製法

3.操作手順

(1)サンプル秤量

  • 空のケルダールフラスコを電子天秤にのせ、ゼロ調節をする。
  • サンプル約 0.5~1 g をフラスコに入れる。
  • サンプルを入れたフラスコを天秤に載せて秤量、サンプル量を記録。
    生臓器の場合、3~5 mm角ぐらいにカットして入れる。
    ホルマリン固定材料の場合は臓器表面のホルマリンをキムワイプで軽く拭き取った後、カットしてフラスコに入れる。

ホルマリンを拭き取る
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3~5 mmカット
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フラスコに入れる
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重量測定
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(2)硝酸10 mlを加える

硝酸添加後、一晩置くと良く分解され、突沸しにくい。
硝酸の量はケルダールフラスコ容量の1/2以下にする。

硝酸添加直後
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硝酸添加10分後
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硝酸添加一晩放置後
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(3)ケルダール分解装置で加熱分解。

  • 初めは低い温度で行なう。
    泡が出て、褐色の煙が出る
    ケルダールフラスコの首の部分が熱くなる程度
  • 30分を過ぎると泡の出が少なくなってくるので徐々に温度を上げる
    ケルダールフラスコの先端部分が熱くなる
    急速に加熱しないこと。突沸しそうな時は、装置から外して少しさます。
  • 1~1.5 時間後、液量が2~3 ml位になったら、装置からおろして放冷する。

硝酸での分解スタート 試料を分解装置にセット
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分解開始15~20分後褐色ガス、泡が盛んに出る
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泡が出過ぎた時は分解装置から下ろす
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1~1.5時間後、分解液が減り、液も黄色に変化
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(4)過塩素酸:硫酸(4:1)混液を10 ml加え再びケルダール分解装置で加熱分解。

加温は、まず低温で分解、その後1時間ほどかけて高温まで徐々にあげてゆく。
2~3 時間後、泡が出なくなり、液量が2~3 ml、無色もしくは薄い黄色、透明になれば分解終了、放冷する。

このステップでは加熱分解中に過塩素酸が蒸発し、硫酸が残る。

過塩素酸:硫酸混液で分解開始
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混液が温まり泡が出てくる
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液の黄色が鮮やかになる
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泡が出なくなり薄い黄色もしくは透明になり灰化終了(右側)
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(5)灰化液を蒸発皿に移す

  • フラスコ内に蒸留水を3 ml加え灰化液と混合する(発熱注意)
  • 混合液を蒸発皿に移す
  • フラスコに再度蒸留水3 mlを入れ共洗いし、蒸発皿に加える、この操作をもう一度繰り返す

(6)蒸発皿をケルダール分解装置上で加熱し溶媒を蒸発させる

  • 蒸発皿の上部(20 cm位)にアルミ箔でゴミよけのおおいをし、加熱する。
  • 完全に蒸発する直前に装置から降ろし放冷する。
    乾固すると測定成分が失われることがあるので注意!!

(7) 6N 塩酸で再溶解

  • 蒸発皿に 6N 塩酸 10 ml入れ試料を再溶解する
  • パスツールピペットを用い蒸発皿内部をよく洗い溶解する
  • 100 mlのメスシリンダーに再溶解液を入れる
  • 蒸留水で蒸発皿を共洗いし、洗液をメスシリンダーに加える(2回洗う)
  • 蒸留水を加え全量を60 mlにする(塩酸の終末濃度は 1N になる)。

(8)原子吸光装置で測定。

  • 銅は324.8 nm 、亜鉛は213.9 nm の吸収波長を測定する
  • 銅は(7)で作成した液をそのまま測定
  • 亜鉛は(7)で作成した液を2倍希釈し測定(希釈液は 1N 塩酸)

灰化液とフラスコを共洗いした液を蒸発皿(るつぼ可)に入れる
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上部にアルミ箔でゴミよけの覆いをする
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蒸発したら6N 塩酸で再溶解、蒸留水でとも洗いし全量を60 mlにする
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原子吸光装置で測定
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4.補足説明

(1)検量線

標準溶液から検量線を作成する
定量演算機能が付いていれば機械が作成する、サンプルを測定すると自動的に濃度が計算されプリントアウトされる

(2)計算

検量線から得られたデータを下記の式に当てはめれば臓器中の銅、亜鉛の量が求められる

a×(b/c)÷d = μg/g

a:検量線から得られたデータ(μg)
b:再溶解液量(銅は60 ml、亜鉛は120 ml)
c:標準液量(銅、亜鉛とも100 ml)
d:試料量(g)

(3)正常値(当研究所調べ)

成牛

  • 肝臓Cu 20~30 μg/g
  • 腎臓Cu 5 μg/g

成牛

  • 肝臓Zn 30~50 μg/g
  • 腎臓Zn 20 μg/g

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