動物衛生研究部門

細菌検査マニュアル

C型およびD型ボツリヌス診断プロトコール (2012年8月改訂版)

更新日: 2012年8月27日

診断プロトコール | 必要な器材 | 培地および試薬の作製 |

C型およびD型ボツリヌス診断プロトコール

※上の図をクリックすると拡大表示されます。

(1) 被検材料

血清:10~15 ml程度
糞便:50 g程度
胃、小腸および結腸内容など:50 g程度
土壌・飼料など(原因と推定されるもの)50 g程度

  • (注1) 血清や肝臓などの臓器は必ずしも必要ない。重要なのはルーメンや腸内容物。剖検したら第一胃内容、座り込んだものは直腸便をとるとよい。その他、エサ、土壌など。
  • (注2) 採取後冷蔵、速やかに検査へ。残った糞便などは冷凍保存しておく。
  • (注3) サンプリングはそれぞれ数カ所ずつ行う方が良い。

(2) 検体処理(培養&マウス試験)

(希釈等は全て抗生物質の入っていないゼラチン希釈液pH6.2を使用)

  • 検体(糞便、飼料、土壌など)20 gにPBS 20 ml程度を加え、ストマッカーで200 rpm 30秒処理し、乳剤化する(フィルター付きのストマッカー袋を使うとよい。飼料の時は様子を見ながら希釈液を増やす必要がある)。
  • ストマッカー袋を外側からよく搾りながら、フィルターを通過した懸濁液を出来るだけ回収し、50mlの遠心管に移す。
  • 懸濁液を 3,000rpm (1,000 x g) 10分遠心後、ペレットを下にしながらデカントで上清を新しいチューブに移す。
  • マウス試験用に上清を1~2 mlだけ新しいチューブに移しておく。
  • 残った上清をさらに6,500 rpm (3,500×g) 20分遠心し、デカントで上清を捨てる。
  • 沈渣を1~2 mlのゼラチン希釈液に懸濁する(2mlくらいのピペットを使って2mlのゼラチン希釈液を入れた後、ピペットの先に200μlのチップを付けて、懸濁するとよい)。

(注) 余裕があれば1検体2~4サンプルとり、処理すると毒素および菌を検出できる可能性がより高まる。

(3) 毒素の検出

(マウスはSLCのddY 4週齢♂を推奨)

  • 血液は3,000 rpm (800×g)で15分遠心し、血清をゼラチン希釈液で2倍あるは4倍程度に希釈する。糞便、飼料、土壌などは(2)の処理を行ったサンプルをゼラチン希釈液で2あるいは4倍程度に希釈する(基本的には(2)の4でマウス試験用にチューブに移した上清をゼラチン希釈液で2倍に希釈する[これでfinal4倍希釈となる])。
  • これらを各群1匹以上のマウスに、0.5 mlずつ腹腔内接種する。
  • 注射後24時間までは頻繁に(1,2,4,8,12,18時間目など)、最長4日目まで観察する。ボツリヌス毒素があれば特有の症状(腹壁の振動と陥凹、後肢麻痺、呼吸困難等、動画参照)を呈して死亡する。
  • 残った上清は中和試験のため冷蔵保存しておく。
  • (注1) 検体の希釈倍率はサンプル量や予想される毒素量を勘案して決める。毒素量が少ないと予想される場合、サンプルを希釈せず投与することが望ましいが、サンプル原液を投与すると抽出物質などにより毒素の有無に関係なくマウスが死亡する可能性があることに留意する。このような場合、サンプルの凍結融解を行うことにより、マウス毒性を持つ夾雑物をある程度失活させることができる。
  • (注2) サンプルを100°C 10分(または80°C 20分)加熱してマウスに接種し、非加熱群と比較することは、マウスが死亡した場合、その原因が易熱性の毒素であったかどうかの指標となるが、ボツリヌス毒素であったかどうかの判定はできない。

(optional: II群のB, E, F型菌、G型菌を疑う場合)
マウス接種前に検体をトリプシン処理する必要がある。トリプシンを0.001N HClで2mg/mlの濃度で溶かし、検体の1/10量を加え、37°C30分処理する。トリプシン溶液は使用直前に調整する。

(4) 中和試験

  • (3) (7)で毒素が検出された場合、冷蔵保存しておいたサンプルをゼラチン希釈液で2あるいは4倍程度に希釈し、3本の小試験管に0.5 mlずつ取り分け、それぞれ以下の通り処理する。
    1) 0.5 mlのゼラチン希釈液と混合
    2) 0.5 mlのC型ボツリヌス抗毒素血清 (2 IU/ml)と混合(1 IU/mouseで接種する)
    3) 0.5 mlのD型ボツリヌス抗毒素血清(20 IU/ml)と混合(10 IU/mouseで接種する)
  • 混合後、室温で30分インキュベート。
  • これらをそれぞれ1~3群として各群1匹以上のマウスに、0.5 mlずつ腹腔内接種し、(3)と同様に観察する。
  • 毒素が中和された群のマウスは生存する(中和試験成立)。全群死亡した場合、毒力が高すぎて中和しきれなかった可能性があるのでさらにサンプルを希釈して中和試験を行う。
  • (注1) 中和試験が成立し、生体材料(血清・腸内容など)から毒素が証明されればボツリヌス症と判定される。
  • (注2) (7)培養液中の毒素の検出で2時間以内にマウスが死亡した場合は、25~1,000倍程度に希釈する必要がある。たとえば過去の例では、約2時間でマウスが死亡した培養上清を最終的に(抗体と混ぜた後の状態で)50倍希釈になるように調整して試験したところ、翌日に中和試験が成立していた。
  • (注3) (3) (7)でサンプル中の毒素量が少ないことが予想された場合、予めマウス腹腔内に抗毒素血清を投与し、1時間後にサンプルを投与することで、サンプルの希釈を最小限にすることもできる。
  • (注4) 全群死亡した場合でも、部分的な中和により死亡までの時間に差がでることがある。

府大と動衛研が作製した抗毒素血清について

凍結乾燥してある1アンプルを5 mlの滅菌蒸留水で溶解すると、
抗C型毒素血清は20 IU/ml
抗D型毒素血清は300 IU/ml
の濃度に調整される。溶解後は冷蔵で保存。
これを使用前にさらに希釈する場合はpH6.2のゼラチン希釈液で希釈する。

(5) 直接分離培養

(2)の検体処理で作製した懸濁液を少量取り、卵黄加GAM寒天培地に薄く画線塗抹し、37°C 2日間嫌気培養する。培地は蓋を上にして培養する。また、遊走を抑えるため嫌気ジャーの中にシリカゲルを入れて培地上によけいな水滴が付かないようにする。通常、夾雑菌が多く直接分離は極めて困難である。

(6) 増菌培養

  • (2)で検体処理を行ったサンプルを0.5~1.0 mlずつ強化クックドミート培地4本にパスツールピペット等で移植する(基本的に処理したサンプルは全部接種するようにする=処理したサンプルは残さない)。
  • 1本はそのまま、3本は75°C 15分加熱後、37°C 2~3日間、最長で7日間嫌気培養する。

(7) 培養液中の毒素検出

  • 2~3日間増菌培養をした試験管をピペットで穏やかに撹拌後、培養液を2 ml程度採取し、その一部(0.5 ml程度)を抗生剤入りゼラチン希釈液で4~5倍程度に希釈する。
  • 残りは毒素陽性となった場合に中和試験の用いるため、冷蔵保存する。
  • 各群1匹以上のマウスに0.5 mlずつ腹腔内接種し、(3)と同様に観察する。
  • 陽性の場合、中和反応を行うとともに菌分離を実施する。陰性の場合、さらに嫌気培養を続け、再び毒素検出を行う。
  • (注1) 生体材料から直接毒素が証明出来なくても、増菌培養の培地から毒素が証明出来れば、臨床症状と合わせてボツリヌス症と診断してよい。
  • (注2) (9)疑わしいコロニーを培養後の毒素検出は陽性(本物)なら10倍希釈した培養液でも2時間以内にマウスは死亡すると考えられる。

(8) 分離培養

(7)培養液中の毒素の検出で陽性となった試験管の深部液を分離培地に画線塗抹し、37°C 2日間嫌気培養する。培地は蓋を上にする。また、嫌気ジャーの中にシリカゲルを入れて培地上によけいな水滴が付かないようにする。夾雑菌が多数生育するので複数枚の培地に薄めに塗抹するのが良い。
寒天培地は作った後によく乾燥させておくことがポイント。

(9) 疑わしいコロニーを培養

コロニーを釣菌し、強化クックドミート培地に接種し、37 °Cで2~4 日間、嫌気培養する。なお、乳光反応の程度は菌株によってばらつきがあるので乳光反応の有無を指標にせず、形態の異なるコロニーを多数拾うようにする。

(10)-1 PCR法による毒素遺伝子のスクリーニング

ボツリヌス菌には、サイレント遺伝子(毒素遺伝子が存在するが、毒素産生が確認されない)の存在が知られていること等から、PCR法単独ではボツリヌス毒素産生能の有無を決定できず、最終的にはマウス試験法によって毒素産生性の有無を決定しなければならない。しかし、検体が多く、マウス接種試験が困難な場合、PCR法を利用してスクリーニングすることもできる。テンプレートの作製はタカラのカタログの通りでも良いが、以下の手順で行うと良好な成績が得られるとの報告もある。

テンプレートの作製

  • 増菌または分離培養した試験管を穏やかに撹拌し、培養液を500 μl採取し、12,000 rpm (12,000×g) 5分 遠心する。
  • 上清を捨て、沈渣を50~100 μlの0.01 % Tween-20水溶液に浮遊し、沸騰水中で10分処理する。
  • 12,000 rpm (12,000×g) 5分遠心後、上清をテンプレートとしてPCR mixtureの10 %となるように用いる(100 μlのPCRの系ならばテンプレート10μl加える。)
  • (注1) 強化クックドミート培地はテンプレートDNAの調整には不適なので、一度、BHIに継代した後にテンプレートDNAを調整する。
  • (注2) コロニーからのテンプレート調整はInstaGene等を用いてもよい。

(10)-2 PCR法による毒素遺伝子の型別(C型、D型、C/D型、D/C型の型別)

基本的にはNakamura et al. 2010, Vet Microbiol 140:147-154に従って行う。ただし、この論文のprimer C5Fの配列には誤りがある。反応条件も含め、正しくは以下の通り。

プライマー名 配列
C5F 5'-ATAAAGCAATAGATGGTAGAT-3'
D9F 5'-TTAATATAGAAAATTCGGGTCA-3'
C12F 5'-GTTGGTGAAGTAGATAGATTAAA-3'
C26R 5'-ATATGAATCTTTCCATCTCTTAA-3'
C23R 5'-AACATTAGTATATTGCAAGCT-3'
D15R 5'-ATCTCTAATCCAAAGCATCTG-3'

PCR mixture組成

DW 12.8 μl
10 x ExTaq buffer (MgCl2含有) 2 μl
2.5 mM dNTP 2 μl
Primer 1 0.5 μl
Primer 2 0.5 μl
テンプレートDNA 2 μl
ExTaq 0.2 μl
total 20 μl

反応条件

95°C 5分—95°C 30秒、53°C 30秒、72°C 1分(35サイクル)−72°C 10分
(電気泳動は1~2%のゲルを使うとよい)

判定

組み合わせ C型 D型 C/Dキメラ D/Cキメラ
C5F+C26R + (800bp) - + (800bp) -
D9F+C26R - + (884bp) - + (884bp)
C12F+C23R + (816bp) - - + (816bp)
C12F+D15R - + (713bp) + (713bp) -
  • (注1) このPCRは中和試験でC型かD型か判明した後に、さらにD/CまたはC/Dキメラかどうか調べるためPCRである。菌が分離されている場合などに使用されるもので、培養上清中の毒素遺伝子のスクリーニングには適さない。
  • (注2) 菌からのテンプレートDNA調整はInstaGene等でもよい。

(11) 生化学的性状

分離株の生化学的性状について調べることは夾雑菌と区別するうえで多少の目安にはなるが、本菌の生化学的性状検査は補助的意味しか持たない。

*本プロトコルは大阪府立大学大学院生命環境科学研究科 獣医感染症学教室の方法に基づいて作成してあります。

必要な器材

試薬

・クックドミート培地 500 g(Difco 226730)¥54,600 (Difco製を推奨)
・酵母エキス Oriental製を推奨
・グルコース 500 g(和光 044-00605) ¥1,300
・可溶性澱粉 Difco (217820) 製を推奨
・炭酸カルシウム 500 g (和光 030-00385) ¥2,200
・硫酸アンモニウム 25 g(和光 015-03432) ¥750
・L-システイン塩酸塩 SIGMA C7880-100G(デシケーターで保存)
・GAM寒天培地 300 g (日水 05420) ¥7,800
・リン酸2ナトリウム無水 500 g (和光 197-02865) ¥1,700
・リン酸2水素カリウム 500 g (和光 169-04245) ¥1,250
・ペニシリン(注射用)  
・ストレプトマイシン(注射用)  
・ゼラチン 500 g (和光 077-03155) ¥2,200
・ピクリン酸 25 g (和光 205-08672) ¥2,500
・鶏卵(市販の卵)  
(以下の試薬は必要に応じて準備)  
・C型毒素遺伝子検出用プライマーセット 各100 pmol (タカラ S023) ¥31,000
・D型毒素遺伝子検出用プライマーセット 各100 pmol (タカラ S024) ¥31,000
・CおよびD型毒素遺伝子検出用ポジコン 5 ng (タカラ BS2) ¥10,500
クックドミート培地と可溶性澱粉はDifco製、酵母エキスはOriental製を用いた方がよい。

器具その他

・嫌気ジャー 2.5 L (シャーレ12枚) (BBL 260626) ¥41,800、その他、オキソイド製など
・ガスパック・指示薬 40組 (三菱ガス化学 A-02) ¥10,400
(嫌気指示薬とセット。パックのみの場合 A-03 50個 ¥10,500)  
・シリカゲル 500 g (和光 192-00475) ¥1,250
・深型シャーレ 500枚(ニッスイ 06302) ¥17,700
・フィルター付ストマッカー袋 500枚(栄研器材 TI 7000) ¥14,000
・マウス (体重20 g以上 、4週齢以上ddY、clean mouse)  
・ツベルクリン用注射器 100本 (テルモ SS-01T 2613S) ¥3,400
・アルコール綿  
・一般実験器具(試験管、ピペット、パスツール、遠心機など)  

*上記の試薬・器具は他社製品でも構わないが、クックドミート培地はDifco製が良い。
*価格は参考

培地および試薬の作製

強化クックドミート培地

1. 基礎培地を作製する。

酵母エキス 1 g
グルコース 1 g(府大のprotocolでは0.8g)
可溶性澱粉 0.5 g
L-システイン塩酸塩 0.1 g
硫酸アンモニウム 1 g
D.W. 100 ml
  • 上記試薬を混ぜ、加温溶解する。可溶性澱粉はメーカーにより完全に溶けない場合もある。
  • ビーカーを水に浸けて室温に戻した後、10% NaOHでpH 7.6に調整する。
  • 炭酸カルシウム0.5 g を加える。(溶けない)

2. クックドミート培地に基礎培地を加える。

クックドミート培地 1.25 g
基礎培地 10 ml /中試
  • クックドミート培地(1.25 g)を中試に入れた後、基礎培地をスターラーで撹拌しながら10mlずつ分注する。
  • 蓋をしない状態で試験管を100°Cで5~10分湯煎する。湯煎中に各試験管1回ずつ、ガラス棒でくるくるゆるやかにかき混ぜる(より培地中の空気を抜くため)。
  • 試験管の口の内側に付いた水滴をキムワイプ等で拭いた後、シリコ栓をする。シリコ栓はねじりながら入れた後、少し逆回転して、ねじりをとる(しわを寄せない)。
  • 試験管をオートクレーブ(115°C 15分)し、氷水で直ちに急冷する。

(注) なるべく用時調製する。出来ないときは嫌気ジャーあるいは冷蔵庫に保存して使用直前に沸騰水中で10分加熱後、流水で急冷して使用する。(冷蔵庫でも1週間くらいは保つが、使用前に沸騰水中での加熱と急冷は忘れないこと!)

卵黄加GAM寒天培地(10枚分)

1. 準備

  • ビーカーに生理食塩水を入れ、アルミホイルで蓋をし、オートクレーブで滅菌する(使用する卵黄1個あたりに必要な生理食塩水は20 ml)。
  • ガラス棒もアルミホイルで包み、オートクレーブ滅菌する。
  • 滅菌した生理食塩水は室温あるいは50°Cまで冷却する。

2. システイン溶液を作製する。

L-システイン塩酸塩 0.275 g (最終濃度 0.1%)
D.W. 250 ml
10 % NaOHでpH 7.3に調整  

3. GAM寒天培地を作製する。

GAM寒天培地 20.35 g (最終濃度7.4 %)
システイン溶液 250 ml
オートクレーブ滅菌(115°C 15分)後、50~60°Cまで冷却する。
  1. 鶏卵をヒビテン液に浸し(あるいは表面を十分にアルコール綿で拭き)、卵を割って卵白と卵黄を分離させる。卵黄のみを1.のビーカーに入れ、ガラス棒で混ぜる。
  2. 4.の卵黄生食液を3.のGAM寒天培地に25 ml(最終10 %の割合)加え、泡立てないよう穏やかに撹拌し、シャーレに25 mlずつ分注する。すこし厚めの培地になるので、使用するシャーレは深めの物がよい。
  3. 培地表面を安全キャビネット内で十分乾燥させた後、シリカゲルを入れた嫌気ジャーで1~2日程度保存し、さらに表面を十分に乾燥させて使用する。この時、培地は蓋を上にしておく。

ゼラチン希釈液

Na2HPO4 0.4 g
D.W. 100 ml
ゼラチン 0.2 g
  • 上記試薬を混ぜ、加温融解後、1N HClでpH 6.2に調整(イムノクロマト用のサンプルを希釈する時のみpH8.0のゼラチン希釈液を使用。)
  • オートクレーブ(121°C 15分)で滅菌し、4°C保存で保存する。

抗生剤入りゼラチン希釈液

(府大で使われているより簡易化されたプロトコールでは使われていない。)

  • ゼラチン希釈液にペニシリン 300 IU/ml、ストレプトマイシン0.5 mg/mlになるよう加える

リン酸緩衝食塩水(PBS)

Na2HPO4 1.2 g
KH2PO4 0.7 g
NaCl 6.8 g
D.W. 1,000 ml
  • 上記試薬を混ぜ、pH 7.0 に調整する。
  • オートクレーブ(121°C 15分)で滅菌する。

飽和ピクリン酸(マウスのマーキングに使用)

ピクリン酸 3 ~5 g
D.W. または70 % エタノール 100 ml

褐色瓶に入れて遮光保存する。