エンドファイト菌糸染色法
染色液
1.標準染色液
0.5% ローズベンガルの5% エタノール溶液
2.アルカリ性染色液
0.5% ローズベンガルの5% エタノール，2.5% 水酸化ナトリウム溶液
3.水性染色液
0.25% ローズベンガル水溶液
1 および 3 は室温で6カ月保存可，2 は用時調製
染色・鏡検法
生草：
葉鞘（leaf sheath）の内側の上皮を引きはがして，スライドグラス上に置く．（出来ればはがした面を上に）
標準染色液を1，2滴たらし，カバーグラスで覆う．
余分な染色液を濾紙で吸い取り鏡検．
木髄（pith）の場合は，開花している軸（flowering stem）の下側からかき取り，同様に処理．
種子：輸入粗試料を検査する場合には，種子を拾い集めて染色するのが一番良い
種子をアルカリ染色液につけ，膨潤させる（20 ml/g）．染色時間はおよそ16時間．種子がカバーグラスで押しつぶせるほど柔らかくなったら終了．
種子を軽く水洗し，水性染色液に3-6時間つける．
種子をスライドグラス上におき，細かいピンセットを用いてもみ殻を除くと，中からゼリー状の子実がでてくる．これをカバーグラスをかけて押しつぶして鏡検する．
水性染色液染色後の種子は，水に浸漬しておけば数カ月保存可能
乾燥した牧草：（一度に処理できないほどの生草試料がある場合は，乾燥して保存できる）
分けつ部（tiller）を集め送風乾燥し，室温で保存する．
乾燥した分けつ部を10-15 mmに切断し，以後は種子と同様に処理して鏡検．
乾草やストローも同様に処理できる．
鏡検
光源に緑色フィルターをつけ，100-400倍で観察．
細胞壁等とは明らかに異なる赤色の菌糸（hyphae）が観察できる．
種子では，糊粉層と呼ばれる赤色球形の構造のすきまに，糸くずのような菌糸を観察できる．
染色が濃すぎたときは，スライドグラスとカバーグラスの間に蒸留水あるいは2%水酸化ナトリウム水溶液1〜2滴をたらし，余分な染色液を濾紙で吸い取ると良い．
文献
A rapid staining method for detection of endophytic fungi in turf and forage grasses. Saha, D.C. et al., Phytopathorogy, 78, 237-239 (1988)
飼料分析基準法，煮沸により短時間で染色
試料の調製
ペレニアルライグラスあるいはトールフェスクストローを1〜4 mmの粉砕する．あるいは茎を3〜4 cmに切断し，さらに縦に4分割する．
試薬
ローズベンガル染色液：0.25％水溶液．
アニリンブルー染色液：1％水溶液2容に対して1容の85％酢酸を混合．
いずれも冷蔵保存．
染色
試料およそ1 gを100 mlビーカーにとり，2.5％水酸化ナトリウム溶液およそ20 mlを加えて時計皿で覆い，電熱器上で1分間煮沸．
ステンレス金網で試料と水酸化ナトリウム溶液を分別し，試料を水で中性になるまで洗浄．
試料を別の100 mlビーカーにとり，ローズベンガルあるいはアニリンブルー染色液をおよそ20 ml加えてから時計皿で覆い，20分間煮沸．
ビーカーの内側および時計皿を少量の水で洗浄し，1時間放置．
洗浄液が透明になるまで水で洗浄．
沈殿した試料の適量をスライドグラスにとり，カバーガラスをかけて試料を軽く押しつぶしてから鏡検．
文献
飼料分析法・解説-2004-（日本科学飼料協会）
（最終更新：2006.2.3）
