ゲノムスキャニング法を用いたウンシュウミカン変異遺伝子の単離法

要約

本法はウンシュウミカンの枝変りや珠心胚実生由来の系統を対象として、ゲノムスキャニング法による解析で系統間で変異が認められる遺伝子を単離して構造を解析するための手法であり、栽培上有用な形質と遺伝子の関連の解析に広く活用することが出来る。

  • 担当:四国農試・作開部・果樹栽培研・育種工学研
  • 連絡先:0877-62-0800
  • 部会名:果樹
  • 専門:生物工学
  • 対象:果樹類
  • 分類:研究

背景・ねらい

ウンシュウミカンには果実の熟期や糖度等の形質が微妙に異なる「枝変り」と呼ばれる体細胞 の突然変異に由来する系統が多数存在している。四国農業試験場では、近年飛躍的な進歩を遂げている遺伝子解析技術を利用し 、元の系統と「枝変り」系統の間で変異を生じた遺伝子を検出する手法を開発 した(平成9年度成果情報)。本成果は、見出された変異遺伝子を単離する方法を開発 し、その構造を解析することで果実特性の変化に関連した遺伝子の変異解 析の基礎技術を提供し、果樹栽培生理機構の解明に貢献することを目的とした。

 

成果の内容・特徴

  • ウンシュウミカン系統間の遺伝子変異の検出はゲノムスキャニング(RLGS)法で行った 。 RLGS 解析では全 DNA を二次元電気泳動で分離するが、ゲル中の目的 DNA は極微量しか存在せず、また目的外の DNA が多量に夾雑している。そこで目的 DNA の両末端に存在する既知の制限酵素切断部位の配列を利用し、これに相補的な配列を持つ DNA を化学合成して目的 DNA に付加したのち、付加した DNA 内の配列を利用したポリメラーゼ増幅反応(PCR)を行うことで、混在する夾雑 DNA を増 幅することなく目的の DNA 断片のみを増幅してクローニングする手法を開発した。
  • ウンシュウミカン「宮川早生」について制限酵素 NotI を用いた RLGS 解析を行い、2つの遺伝子座から上記の手法を用いてそれぞれ DNA をクローニングして塩基 配列を決定した。得られた遺伝子座の一方は調査した 10 系統すべてに存在しており、タバコやイネ、マツ等の既知の葉緑体 DNA の一部の配列と高い相同性を示したこと、この遺伝子座が多コピーであったことや分子サイズ 等から、目的とする DNA がクローニングされたと考えた。
  • もう一方の遺伝子座は、「宮川早生」には見出されるがその枝変り系統である「 宮本早生」には見出されない( 図1 )。得られた塩基配列は既知の配列とは相同性が認められなかったが、この DNA 断片をプロ ーブとするサザンハイブリダイゼーションでは両系統間で異なるバンドが存在することが確認 された( 図2 )。同一系統の複数の個体で同 じ結果が得られたことや、分子サイズ、構造等から、目的と する系統間で変異した遺伝子座であると判断した。

成果の活用面・留意点

本手法により、在来のウンシュウミカンの原系統と変異系統間で変異の認められる遺伝子を効 率よく単離し、その性質を詳しく解析すること が可能となる。また、他の作物についても体細胞突然変異を利用した解析に適用することが可 能である。RLGS 解析には放射性物質を用いるため、実施に当たっては放射性物質の実験施設が必要である。

具体的データ

図1 変異スポットのクローニング

図2 サザンハイブリダイゼーションによる変異の確認

その他

  • 研究課題名:カンキツの枝変りと遺伝子の変異に関する研究
  • 予算区分 :科振調(重点基礎)
  • 研究期間 :平成 10 年度
  • 研究担当者:清水 徳朗、 河瀬 真琴、富岡 啓介
  • 発表論文等:Restriction landmark genomic scanning (RLGS) method for genetic analysis in crop plants, 第 18 回国際遺伝学会,北京市(中国), 1998.
    RLGS 法によるウンシュウミカンの有用遺伝子の解析,四国農試ニュース, No.77, 1998.
    ウンシュウミカン系統の RLGS 解析とスポットクローニング,平成 10 年日本分子生物学会,263, 横浜, 1998.
    ゲノムスキャン法によるウンシュウミカンの遺伝子変異の解析,園芸学会雑 誌,68(別1), 138, 1999.