ストロビルリン系薬剤耐性菌のPCR-RFLPによる遺伝子診断

[要　約]
キュウリべと病菌のストロビルリン系薬剤耐性菌と感受性菌では，薬剤の作用点タンパク質の遺伝子に１塩基の違いが見られる。PCR-RFLPによって耐性菌を迅速に診断することが可能である。
[担当研究単位]　農業環境技術研究所　資材動態部　農薬動態科　殺菌剤動態研究室
[部会名]　農業環境・農業生態
[専　門]　薬剤
[対　象]　微生物
[分　類]　指導
[背景・ねらい]
最近，天然物をリード化合物とするアゾキシストロビンやクレソキシムメチルのようなストロビルリン系薬剤が開発されたが，キュウリべと病菌ほかで耐性菌問題が生じた。そこで，人工培養できないこの菌のストロビルリン系薬剤耐性菌を迅速に検出するために，耐性の遺伝子診断法を検討する。
[成果の内容・特徴]
  1. キュウリべと病菌のストロビルリン系薬剤耐性菌では，薬剤作用点タンパク質のチトクロームbの遺伝子に１塩基変異（GGTGC→GCTGC）がみられ，アミノ酸置換が推定される（図１）。
  2. べと病菌の精製ゲノムDNAから，チトクロームb遺伝子の部分領域をPCRで増幅後，制限酵素ItaIで処理したところ，耐性菌のPCR産物にのみこの酵素の認識部位が存在することが，電気泳動で確認された。
  3. 遊走子のう形成が見られるキュウリ罹病葉から，直径１cmのディスクを１枚打ち抜き，キットを用いて菌のDNAを抽出，精製した。これを鋳型として，同様のPCR-RFLPを行うことにより，べと病菌の耐性菌が検出できた（図２，図３）。
  4. 菌のゲノムDNAの抽出，精製から，耐性菌診断までを１日で行うことが可能である。
[成果の活用面・留意点]
　PCR-RFLPによるストロビルリン系薬剤耐性菌の診断は，うどんこ病菌等でも可能であることから，絶対寄生菌や生物検定が困難な菌の薬剤耐性菌を迅速に検出できる。これは，被害の発生や拡大の回避に役立つ。

具体的データ

[その他]
 研究課題名 ： 植物病原糸状菌の薬剤耐性機構の解明
 予算区分　 ： 経常・国際交流［薬剤耐性遺伝子］
 研究期間　 ： 平成12年度（平8〜9〜12年度）
 発表論文等 ： １）植物病原菌のストロビルリン系薬剤耐性菌と耐性機構に関する考察, 第10回殺菌
　　　　　　　 　　剤耐性菌研究会シンポジウム講要集 (2000)　
　　　　　　 　２）Occurrence and molecular characterization of strobilurin resistance in
　　　　　　　 　　cucumber powdery and downy mildew, Phytopathology, in press
　　　　　　 　３）PCR-RFLPによるストロビルリン系薬剤耐性菌の遺伝子診断, 日植病大会講要集
　　　　　　　 　　192 (2001)
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