動物遺伝資源の特性評価のためのマイクロサテライトDNAの効率的単離法

[要約]
　動物遺伝資源の特性評価に資するため、マイクロサテライトDNAのゲノム中コピー数が少ない家禽において、pCR－Scriptべクター、点変異導入法および mung bean ヌクレアーゼを組み合わせることによってその効率的単離法を開発した。 
農業生物資源研究所・遺伝資源第一部・動物探索評価研究チーム
[連絡先]0298-38-7041
[部会名]生物資源　　畜産
[専門]　遺伝資源　　育種・遺伝
[対象]　家禽類　　　家禽類
[分類]　研究　　　　研究

[背景・ねらい]
　マイクロサテライトDNAは、数塩基の配列が繰り返しているもので、その代表としてCAリピートがある。マイクロサテライトDNAは、各染色体に広く分布し、対立遺伝子（a1lele）数が多いことから遺伝子マーカーとして哺乳動物の遺伝解析に広く用いられている。ところが家禽においては、既知のマイクロサテライトDNAマーカーは少ない。また、家禽のマイクロサテライトDNAの１ゲノムあたりのコピー数は、哺乳動物の約10分の１と少なく、従来法では新たなマイクロサテライトDNAのクローニングにかなりの時間と労力を要する。本研究では、マイクロサテライトDNAを応用した動物遺伝資源の遺伝特性評価に資するため、マイクロサテライトDNAの効率的なクローニング法を開発する。

[成果の内容・特徴]

  1. 点変異導入法（Kunkelら、1988）の操作手順を哺乳動物のマイクロサテライトDNAのクローニングに応用した方法（Ostranderら、1992）を改変し、家禽のマイクロサテライトDNAの効率的なクローニング法を開発した（図１）。
  2. この方法を用いた場合、表１のようにOstranderらの方法をそのまま家禽に応用した場合より、30倍以上効率的にマイクロサテライトDNAを単離できる。
  3. この方法では、PCR産物クローニング用に開発されたプラスミドベクターpCR－Script（Stratagene）を使用することにより、脱リン酸化処理を施したDNA断片のクローニング効率を上げ、さらに大腸菌XL1－B1ue MRF’を使用することによって形質転換効率を上げた。これによって、プライマー伸長反応に供与するクローン数を飛躍的に増加させた。
  4. CAリピートを含むクローンを選択する目的で、調製した一本鎖DNA、（CA）10オリゴヌクレオチド、dNTP、耐熱性ポリメラーゼを混合し、高温下でプライマー伸長反応を行った。その後、一本鎖DNA特異的分解酵素である mung bean ヌクレアーゼを作用させることで、二本鎖DNAの効率的な選別を可能とした。
    （図２）

[成果の活用面・留意点]
　本法は、すべての動物種においてマイクロサテライトDNAの効率的クローニング法として応用できる。 
[その他]
研究課題名：動物遺伝資源評価のためのDNA多型マーカーの開発
予算区分  ：経常
研究期間　：平成７年度（平成６～８年度）
発表論文等：1)Takahashi et al. :An efficient method to clone chiken microsatellite repeat sequences.
           Japanese poultry science in press.
           2)Takahashi et al. Efficient cloning method to detect microsatellite markers in chikens. 
           第20回 ベルツビルシンポジウム講演要旨　p32,1995
           3)高橋ら：多型DNAマーカーの効率的クローニング法の検討。日本畜産学会大会講演要旨　p177,1995
           4)高橋ら：ニワトリのマイクロサテライトDNAマーカー単離の効率化  平成７年度日本家禽学会秋季大講
           演要旨 p11,1995
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