昆虫遺伝子の機能解析に有効なコクヌストモドキ培養細胞株の樹立

［要約］

甲虫目のモデル昆虫「コクヌストモドキ」の胚由来の培養細胞株Tc81を樹立し、それを用いて幼若ホルモン(JH)シグナル経路の解析を行った。本細胞は高いRNA干渉効果を示し、また外来遺伝子の導入が容易であるため、JHシグナル経路だけでなく、様々な昆虫遺伝子に対する汎用的機能解析ツールとしての利用が見込まれる。

　貯穀害虫である甲虫「コクヌストモドキ（Tribolium castaneum）」は、飼育が容易で、ライフサイクルが短いことや、ゲノム情報が解読されていること、また個体へのdsRNA注射によるRNAiの効果が非常に高いことから、ショウジョウバエに次ぐモデル昆虫として多くの研究室で使用されている。しかしながら、遺伝子機能解析に有効なコクヌストモドキ培養細胞株は、これまで報告されていない。そこで本研究では、コクヌストモドキ胚由来の細胞株Tc81を樹立し、RNAiや遺伝子導入の効果を調査すると共に、JHシグナル経路の解析を行い、本培養細胞株の有効性を検証した。

1. コクヌストモドキ胚由来の培養細胞株Tc81を樹立することに成功した。Tc81細胞は、多数の細胞が集まって不定形の袋状の細胞群（小胞）を形成し、浮遊性を示した（図1）。
2. Tc81細胞は、培地中に低濃度のdsRNAを添加するだけで高いRNAi効果を示し、その効果は１週間以上持続した（図2）。
3. Tc81細胞は高いJH応答性を持ち、JH誘導性の変態抑制遺伝子Krüppel homolog 1（Kr-h1）が極低濃度のJHにより短時間で誘導された（図3）。
4. Tc81細胞は、遺伝子導入とレポーターアッセイを容易に行うことができる。例えば、Kr-h1のJH応答配列（JHRE）の下流にホタルルシフェラーゼ（レポーター遺伝子）を連結したプラスミド（JHRE-レポーター）を、トランスフェクション試薬を用いてTc81細胞に導入することで、JH依存的なレポーター活性が得られた（図4）
5. Tc81細胞でJH受容体Methoprene tolerant遺伝子（Met）、およびそのパートナーであるSteroid receptor coactivator（SRC）遺伝子のRNAiを行うと、いずれの場合もJHによるJHRE-レポーターの活性が減少した（図4）。この結果から、以前報告したカイコと同様、コクヌストモドキにおいてもMetとSRCの両者がJH依存的にJHREに作用することで、Kr-h1遺伝子の発現が誘導されていることが確認された。甲虫目のコクヌストモドキと鱗翅目のカイコで共通のJHシグナル経路が保存されていることが明らかになった。
6. Tc81細胞は樹立後3年以上（150代以上）継代しているが、外部形態、RNAi効果、トランスフェクション効率およびJHに対する応答性に顕著な変化は認められず、細胞株の諸性状は非常に安定している。
   

1. 本細胞株はRNAiおよび遺伝子導入が容易に行えるため、JHシグナル経路だけでなく、様々な生命現象に関わる昆虫遺伝子の機能解明において汎用的かつ強力なツールとなると期待される。
2. 本細胞株は、甲虫目害虫に対する新規制御剤スクリーニング系の開発にも利用できる。

	図1　Tc81細胞の形態 (A) 多数の細胞からなる小胞を形成する。 (B) DAPI色素によるDNA染色により、格子の1つ1つが細胞であることがわかる。
図2　Tc81細胞のRNAiの効果 (A) Met遺伝子のdsRNA（dsMet、終濃度50 ng/µl）を培地に添加すると、2日後にはMet遺伝子の発現量が1/4まで低下し、1週間以上効果が持続する。 (B) dsMetの終濃度が0.05 ng/µlでも、高いRNAi効果が得られる。dsMalEはネガティブコントロール。	図3　Tc81細胞のJHに対する応答性 (A) Tc81細胞にJHアナログ（メソプレン、終濃度10µM）を添加すると、Kr-h1遺伝子の発現量が１時間でピークに達するほどの早い応答性を示す。 (B) 極低濃度のJH種（10-11M）でもKr-h1遺伝子が誘導される。
	図4　Tc81細胞を用いたJHシグナル経路の解析 Met遺伝子とSRC遺伝子のRNAiを行うと、JHRE-レポーターの活性が有意に低下する。dsMalEはネガティブコントロール。

［その他］