リバースドットブロットハイブリダイゼーション法によるネグサレセンチュウの同定

［要約］
ネグサレセンチュウ7種それぞれに特異的な遺伝子配列より種特異的プローブを作製し、リバースドットブロットハイブリダイゼーション法を用いて、1回のハイブダイゼーションで、その線虫種を迅速に同定する技術を開発した 
北海道農業試験場・生産環境部・線虫研究室
［連絡先］011-857-9247
［部会名］生産環境
［専門］作物虫害
［対象］害虫
［分類］研究

［背景・ねらい］
わが国にネグサレセンチュウ(Pratylenchus spp.)が、20種以上確認されており、農業上重要な種を含んでいる。これらの種の形態的同定には多大な労力と熟練を要するため、迅速で確実な同定法の確立が求められている。近年開発されたドットブロットハイブリダイゼーション法や種特異的プライマーを用いた同定法では、1度の分析で確実に種を同定することは困難である。そこで、1回の分析で確実に主要種が同定できるリバースドットブロットハイブリダイゼーション法を検討する。

［成果の内容・特徴］
  1. キタネグサレセンチュウ、ミナミネグサレセンチュウ、クルミネグサレセンチュウ、チャネグサレセンチュウ、パイナップルネグサレセンチュウ、ノコギリネグサレセンチュウ、モロコシネグサレセンチュウの7種のそれぞれの種に特異的な18S−5.8SリボソームRNA遺伝子間に存在するスペーサー領域の塩基配列を見いだし、その配列に基づいてプローブを作製し、それらのプローブ全てをのメンブラン上に並べ固定する。
  2. 同定したい線虫の18S−5.8S領域をPCR法を用いてジゴキシゲニン(DIG)標識し、その標識したDNA断片と上記のメンブランを用いてハイブリダイゼーション反応を行うと目的の線虫種において特異的シグナルのみ検出できる(35地域個体群につき3回以上確認)(図1)。
  3. この方法で、上記7種の幼虫を含むの全ステージの同定が、1頭で可能である。

［成果の活用面・留意点］
  1. プローブは公的研究機関へは供給できる。
  2. 本方法(リバースドットブロットハイブリダイゼーション法)は、1回のハイブリダイゼーション反応で、複数の線虫種の中から確実な同定ができ、他の病害虫診断にも適用できる。
［その他］ 
研究課題名：ネグサレセンチュウ類の種間・種内における生化学的特性の解明
予算区分　：経常
研究期間　：平成10年度(平成8〜11年度)
発表論文等：リバースドットブロットハイブリダイゼーション法を用いたネグサレセンチュウの同定,日本線虫学会第6回大会講演要旨

Rapid and sensitive identification of Pratylenchus spp. using reverse dot blot hybridization, Nematology (投稿中)
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