DAS-ELISA法（エライザ法）

 
 

  1. メニュー

  2. (1)原理と種類

  3. (2)準備

  4. (3)実際の手順

  5. (4)注意点

  6. (5)粘着トラップを用いた検出（応用）


(1) 原理 と種類

　抗原抗体反応を利用します。このため、検出対象となるウイルスに特異的な抗体が必要です。用いる抗体の種類により直接ELISA、DAS-ELISA、TAS-ELISAなどがありますが、それぞれ操作が異なるため、注意が必要です。詳しくはこちらをご参照ください。


(2) 準備

抗体

全ての種類の抗体が手に入るわけではありませんが、主な抗体は以下で販売しています。（クリックするとそれぞれのサイトに移ります）

  1. 箇条書き項目 日本植物防疫協会

  2. 箇条書き項目  Agdia（直接購入するより割高となるが、和光が代理店をしている）

  3. 箇条書き項目  DSMZ (ドイツ細胞バンク、上記２つに無い抗体も用意されている）

どんなウイルスの抗体があるかは、それぞれのサイトをご参照ください。


試薬

  1. 箇条書き項目 炭酸バッファー [Carbonate Buffer (0.05M  pH9.6)]

  2. • Na2CO3（無水）  0.80g    (0.015Ｍ）

  3. • NaHCO3    1.47g    (0.035Ｍ）


  1. 500mlの蒸留水に溶解する（pH調整不要)

  2.    (腐敗防止のためにNaN3  0.1gを加えると良い。入れない場合は冷蔵する）


  1. 箇条書き項目 PBST (0.02M  pH7.4)

  2. •  NaCl    8.0g

  3. •  KH2PO4     0.2g

  4. •  Na2HPO4･12H2O    2.9g

  5. • KCl    0.2g

  6. 1000mlの蒸留水に溶解した後、Tween20(相当品でも良い）を0.5ml加える。

  7. (意外と多く消費するので、10倍濃度で作成しておき、必要なときに薄めておくと良い）


  1. 箇条書き項目 クエン酸バッファー [ Citrate buffer (0.1M) ] (DAS-ELISAでは使わない)

  2. •Trisodium Citrate Dihydrate   29.41g

  3. • Mercarpto Acetic Acid          0.5ml


  1. 1000mlの蒸留水に溶解する（pH調整不要)


  1. 箇条書き項目4) ジエタノールアミン溶液 [Diethanol amine Substrate Buffer(pH9.8)]

  2. •Diethanol amine    48.5ml

  3. •蒸留水              400ml

  4. よく混合し、1N HCl (約30ml) でpH9.8に調整する

  5. 蒸留水で500mlに調整した後、

  6. •MgCl2･6H2O          50mg

  7. •NaN3                 0.1g　      を加える


器具

  1. 箇条書き項目マイクロタイタープレート（96穴）住友ベークライトのMS-8696F推奨

  2. 箇条書き項目マイクロピペット（20μl〜200μl用、マルチチャンネルのものが便利）

  3. 箇条書き項目マイクロチップ（20μl〜 200μl用）

  4. 箇条書き項目マイクロプレートリーダー（吸光値測定用）

  5. 箇条書き項目冷蔵庫（4〜10℃，プレート保管用）

  6. 箇条書き項目恒温器（37℃常温，抗体吸着，インキュベーション用）


(2) 実際の手順


ここでは、一般に使われているDAS-ELISAを紹介します。（参考：日本植物防疫協会）

  1. 1.コーティング液（一次抗体）をカーボネート緩衝液で所定濃度に希釈 し，マイクロプレートの各穴に200μlずつ分注する。

  2. 2. 37℃で3時間または4℃で1晩静置する。

  3. 3.マイクロプレートのコーティング液を捨てる

  4. 4.PBSTを適量入れ、捨てるという操作（洗浄）を4回繰り返す (試料準備）

  5. 5.検定試料を0.1g程度とり、10倍量のPBSTで磨砕し、マイクロチューブ に入れる。この際、必ず、非感染の植物（ネガティブコントロール）と感 染の分かっている植物（ポジティブコントロール）を用意し、同様の処理 をする）

  6. 6.遠心分離（10,000 rpm 1 min程度）

  7. 7.上澄みを200μlずつ分注する。

  8. 8.37℃で3時間または4℃で1晩静置する

  9. 9.マイクロプレートをPBSTで4回 洗浄する。

  10. 10.コンジュゲート液（二次抗体）をPBSTで所定濃度に希釈し，マイクロ プレートの各穴に200μlずつ分注する。

  11. 11.37℃で3時間または4℃で1晩静置する

  12. 12.マイクロプレートをPBSTで4回洗浄する。

  13. 13.P-ニトロフェニルリン酸2ナトリウム（基質）をジエタノールアミン 溶液20mlに溶解する。（使い切る）

  14. 14.200μlずつ分注する。

  15. 15.光が入らないようにアルミホイルをかぶせ、室温に置く

  16. 16.30分後、405 nmの吸光度値を測定する

  17. 17.1回目の測定で十分発色が得られていない場合は、120分後、 もう一 度405 nmの吸光度値を測定する (結果判定）


(4) 注意点

  1. 箇条書き項目陽性の判断基準は？

  2. ELISAでは必ずネガティブコントロールをとってください。 雑草、キク、イモ類などは非得意反応がでやすいとされているので、必ずネガティブコントロールを用意してください。 植物病理の分野では、ネガティブの吸光値の２〜３倍を示すものを陽性と判断することが多いようです。ウイルスの診断をする場合には、ネガティブは非得意反応が無いことの確認ですので、これで問題ないと思います。しかし、媒介昆虫の獲得率や無病徴感染のように値が低いものの場合は、 統計的にはネガティブの平均値+SD*3以上を陽性と見なすべきだと考えます。その場合には、ネガティブは５〜１０反復は必要になります。

  3. 箇条書き項目プレートについて

  4. 実は、最近までプレートは研究室にあった古いものを使っていたのですが、陽性コントロールが出なかったり、陰性が出てしまったりと不思議な反応をしたため、新しいプレートを購入して比較してみました。すると、変な反応は古いプレートに特有で、新しいプレートはバックグラウンドも低く非常に良好でした。考えてみると、ELISAにはタンパク質を吸着するためのコーティングがされており、当然、経時劣化すると思われます。また、プレートの種類により、吸着性、バックグラウンドも多少差があるようです。こちらにあるような、微妙な試験の場合は、なるべく良い（おすすめは住友ベークライトのMS-8696F)ものを使いましょう。

  5. 箇条書き項目Blockingについて

  6. 植物ウイルスのELISAでは通常、非得反応を抑えるBlockingはしないようです。経験的に、ほとんど問題ありませんが、反応が微妙な場合はBlockingをした方が良いようです。昆虫からのウイルス検出には、Blocking操作を加えておきました。