Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP法）

 
 

  1. メニュー

  2. (1)原理と種類

  3. (2)準備

  4. (3)実際の手順

  5. (4)注意点

  6. (5)使用器具に関する考察


(1) 原理 と種類

　LAMPとはLoop-Mediated Isothermal Amplificationの略であり、栄研化学が独自に開発した、安価、迅速、簡易、精確な遺伝子増幅法です（栄研化学ウェブサイトより）。詳しくはこちらをご参照ください。


(2) 準備

現在、LAMP法に必要な試薬はすべてキットに含まれています。

LAMP法のキットはプライマーがセットになった専用のものと、汎用のものがあります。

  1. 箇条書き項目カンキツグリーニング病診断キット（お勧め！）

  2. 箇条書き項目トマト黄化葉巻病診断キット

  3. 箇条書き項目DNA増幅試薬キット

  4. 箇条書き項目RNA増幅試薬キット（RT-LAMP）

汎用のものは、独自にプライマーを用意する必要があります。


器具・機械

  1. 箇条書き項目微量遠心機（可能なら冷却機能付）

  2. 箇条書き項目マイクロチップ（20μl〜 200μl用）

  3. 箇条書き項目PCRチューブ

  4. 箇条書き項目サーマルサイクラーまたはインキュベーター

  5.     インキュベーターについて考察を行いました。

  6. 箇条書き項目（推奨）フィルター付きチップ

  7. 箇条書き項目（推奨）クリーンベンチ

  8. これらは必須ではありませんが、汚染による擬陽性の防止に効果があります。


(3) 実際の手順（ここでは、蛍光・目視検出試薬 を使用した場合の反応を説明します）

  1. 1.試薬とプライマーを反応数+1倍して、チューブに混合する（専用キットの場合は、プライマーも混合されています）

  2. 2. PCRチューブに分注する

  3. 3.DNAテンプレートを加え、軽く遠心して試薬を落とす。

  4. 4.やさしく混合して、再度遠心して試薬を落とす。

  5. 5.必ず温度が65℃（63℃〜65℃）に達してから（Hot start酵素は除く）、装置にチューブをセットする。

  6. 6.（サーマルサイクラーの場合、85℃ 5min処理を行う）

  7. 7.判定（反応後のチューブは出来るだけ開けない）


判定

判定法には、以下の方法があります。

  1. 箇条書き項目蛍光・目視検出試薬による判定（推奨）

  2. 箇条書き項目反応液の白濁の有無

  3. 箇条書き項目濁度測定による測定

  4. 箇条書き項目電気泳動（非推奨！）


  6. 通常の反応では、蛍光目視試薬による確認を推奨します。

  7. 蛍光目視試薬を用いた場合、下図のように陽性なら蛍光を発します。








左４本が陽性（増幅あり）、右２本が陰性（増幅なし）

試薬の説明書にはUV下で観察するように書いてありますが、写真を見て分かるように室内光下でも十分判別できます。

なお、LAMP反応物の電気泳動を行うと、下図のようにラダー状のバンドが見えますが、コンタミネーションによる擬陽性の原因となるため、自作プライマーの特異性の確認等、特殊な場合を除いて電気泳動は行わないでください。


(4) 注意点

  1. 箇条書き項目陽性の判断基準は？

  2. LAMPでは陽性と陰性がかなり明確に分かれるようで、PCRのように薄いバンドというものが出ません。このため、陽性と陰性の判断は明確です。しかし、検出限界域では、リアルタイム濁度計を使った場合でも増幅したりしなかったりという現象が起きます。もともと感度が非常に高いので、通常の検出では考慮する必要はないですが、非常に低濃度のウイルス感染（潜在感染など）を検出する場合は、２〜３反復を行うことを推奨します。

  3. 箇条書き項目コンタミネーションについて

  4. LAMPは非常に感度が高いため、わずかのコンタミネーションにより擬陽性が生じる危険性があります。このため、反応後のチューブは開けずにそのまま廃棄してください。通常は、フィルター付きのチップを使えば大丈夫ですが、クリーンベンチを使って隔離できるとより安全です（万一、コンタミネーションが起きていても殺菌灯によりDNAが破壊される）。

  5. 箇条書き項目プライマーの設計について

  6. LAMPプライマーはPCRプライマーと比較して、格段に条件が難しいため、手作業で設計するのはまず無理です。Primer Exploreを利用してください。

  7. LAMP反応ではプライマーを４本使用する反応と、さらにLoop primerを加えた反応がありますが、Loop primerを加えた反応はより安定かつ効率的に増幅が得られるため、LAMPではLoop primerを加えた反応を推奨します（カンキツグリーニング検出キットにもLoop primerが含まれています）。実際に、自分で、LAMPプライマーを設計する場合は、最初に４つのプライマー(FIP, BIP, F3, B3)で増幅と特異性を確認してから、Loop primerを加えるようにするのがよいと思われます。

  8. しかし、PrimerExploreでは、最初に４つのプライマー(FIP, BIP, F3, B3)を提示し、その後でLoop primerを探索する設計になっていますが、配列によってはLoop primerが得られない場合もあるため、プライマー設計の段階でLoop primerが作成可能かどうか確認してから、反応を行うようにした方が良いです。


(5) LAMP反応に用いるインキュベータとチューブに関する考察を行いました。

参考にしてください。（リンク先に移ります）