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牛の胚移植における受胎率向上への栄養膜小胞の利用

［要約］

体外受精胚移植後および過剰排卵後14日目及び16日目に回収した伸張期胚盤胞の栄養膜細胞を細切・培養することで栄養膜小胞の作出が可能である。作出した栄養膜小胞を胚と同時にダイレクト法で凍結後、共移植を実施した結果、受胎率が向上する。

［キーワード］

伸張期胚盤胞、栄養膜小胞、共移植、受胎率向上

［担当］

熊本農研セ・畜研・生産技術開発部

［連絡先］電話096-248-6435	
［区分］九州沖縄農業・畜産草地（動物バイテク）	
［分類］技術・普及	

［背景・ねらい］

牛の胚移植技術の普及において、受胎率の向上は必須であるが、ここ数年受胎率は50%前後を推移している状況である。近年、着床胚の栄養膜（Trophoblast）細胞が産出するインターフェロンτが胚と母胎間の妊娠認識や黄体退行阻止による妊娠維持に関与しているという報告がされている。また、栄養膜を細切し、短期間培養後に形成される栄養膜小胞（Trophoblastvesicle、以下TBV）を胚と共移植することにより受胎率向上の可能性が報告されている。今回、これらの知見を実証し、受胎率向上へ活用するためTBVの作出試験及び凍結融解試験並びに共移植による移植試験を実施することとする。

［成果の内容・特徴］

1. 採胚
   

   1）体外受精胚移植後回収区(IVF区）
   

   • 当所の定法により体外受精胚を作成し、凍結融解後短時間培養、生存性を確認した胚10〜20個を7日目に移植し14(day14)及び16日目(day16)に採胚。
     

   • その結果、回収個数はそれぞれ24個、18個、伸張期胚盤胞数はそれぞれ11個、6個である。
     

     2）過剰排卵後回収区(SOV-AI区）
     

   • 当所の定法による過剰排卵処理後の14及び16日目採胚を実施。
     

   • その結果、回収個数はそれぞれ30個、21個、伸張期胚盤胞数はそれぞれ19個、13個である。（表1）
     

   • なお、採胚は、2孔式バルーンカテーテルを使用。
     

2. 伸張期胚盤胞の細切及び培養
   
   • 回収した伸張期胚盤胞の内細胞塊を外科用メスで切除し、栄養膜を1〜1.5mmに押し切るように細切し、切断面を嚢になるように塞ぐ。
     

   • 細切した栄養膜を、100μMβME添加20%CS-TCM199中で、摂氏38.5度、5%CO2inairの気相条件により20時間培養し、小胞を形成したものをTBVとする。
     

   • その結果、IVF区及びSOV-AI区それぞれ切断後個数81個、228個、TBV個数68個、210個である。（表1）
     

3. TBVの凍結・融解及び生存性
   
   • 作成したTBVを10%エチレングリコールで、0.25mlストロ-1本あたり3個吸引し、緩慢凍結。
     

   • 融解は、空気中10秒保持、摂氏37度温水で静かに融解。
     

   • 融解後、100μMβME添加20%CS-TCM199中で、摂氏38.5度、5%CO2inairの気相条件により培養し、24及び48時間後の小胞の形成及び細胞の増殖を観察。
     

   • その結果、24時間及び48時間後の生存率はそれぞれ89.0%、82.9%である。（表2）
     

4. 共移植試験
   
   • 作出したTBV3個を胚と同じ0.25mlストロー内に吸引し、10%エチレングリコールで緩慢凍結、共移植。
     

   • その結果、共移植区は非共移植区より高い73%である。
     

   • これらのことからTBVの効果があると思われる。（表3）
     

［成果の活用面・留意点］

1. 県内各胚移植機関へのTBV供給及び共移植実施により受胎率の向上を図るため活用する。
   

2. 胚移植技術修得中の技術者は、TBVの取り扱いには十分注意する。
   

3. 汚染など衛生的に注意が必要である。
   

［具体的データ］

表1　伸張期胚盤胞回収及びTBV作出試験成績

表2　TBV凍結融解の生存性試験成績

表3　共移植試験

［その他］

研究課題名：受精卵移植普及定着化事業（技術高度化）.受胎率向上及び受胚牛評価法への栄養膜小胞の利用に関する実証試験
予算区分　：畜総
研究期間　：2000〜2002年度




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