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LAMP法を用いたカンキツグリーニング病の迅速診断

［要約］
LAMP法によりカンキツグリーニング病病原体に特異的な遺伝子領域が短時間に増幅される。反応産物をナイロン膜に固定し、AzurB染色により増幅確認を行うことで、PCR法の1/3以下の時間で本病の診断が出来る。

［キーワード］
カンキツ、LAMP、カンキツグリーニング病

［担当］
九州沖縄農研・地域基盤研究部・病害遺伝子制御研究室 

［代表連絡先］電話096-242-7730	
［区分］九州沖縄農業・病害虫、共通基盤	
［分類］技術・普及

［背景・ねらい］
近年、沖縄県および鹿児島県奄美諸島の一部のカンキツ生産地において、カンキツグリーニング病による被害が広がっている。本病はCandidatus Liberibacter asiaticusという病原体の感染により発症し、感染した木は葉の黄化、落葉、果実の着色不良等の病徴が現れる。しかし、カンキツグリーニング病の病徴は要素欠乏症と類似しており、外見から見分けることは困難であること、病原体は人工培地では培養できないこと等から、PCRによる遺伝子診断が行われている。しかし、PCRは遺伝子増幅装置、電気泳動装置および撮影装置が必要であり、研究設備の整わない現地での迅速な診断および防除に対応できない。そこで、特別な機械を必要としない新しい遺伝子診断技術であるLAMP(Loop-mediated isot hermal amplification)法による迅速診断法を確立する。
［成果の内容・特徴］
  1. カンキツグリーニング病病原体の既報遺伝子の一つであるnusG-rplKAJL-rpoBオペロン領域(DDBJ/EMBL/GenBank登録番号 AY342001)を増幅標的部位として設計したLAMPプライマー（表1）を用いて図1のようにDNA増幅試薬キット（栄研化学株式会社）を調製し、摂氏63度30分間反応を行うことで、標的部位が増幅し、電気泳動により梯子状に観察される増幅DNA断片が得られる（図2）。この増幅はカンキツグリーニング病に感染した検体に特異的であり、本病の診断に利用できる。
  2. 葉の中肋部位を検体として全DNAを抽出し、LAMP反応を行った場合、検出限界は約1ng/反応であり、PCRによる診断と比較して同等以上の感度を有する。

  3. LAMP反応産物を正電荷ナイロン膜に固定後、0.1%AzurB染色を行うことで、特別な装置を用いることなくLAMP法による特異的増幅の有無を確認できる（図3および図4）。

［成果の活用面・留意点］
  1. AzurBによる増幅確認法は全てのLAMP反応による増幅確認に適用できる。ただし、AzurB染色による確認法は反応液中の検体DNA濃度が20ng/μl 以下となるように検体DNA濃度を調製する必要がある。

  2. 反応後の増幅産物が未反応のチューブや試薬に混入することを避けるため、反応試薬の調製はクリーンベンチ等を用いて行う。

［具体的データ］

表1　LAMPプライマーの塩基配列


図1　反応試薬の調製


図2　LAMP法によるカンキツグリーニング病病原体の特異的検出と検出限界


図3　AzurB染色によるLAMP反応の増幅確認法


図4　LAMP反応産物の電気泳動像とAzurB染色による増幅の確認

［その他］ 
研究課題名：病原体のゲノムの解析と迅速遺伝子診断法等の開発
課題ID：07-08-01-01-17-05
予算区分　：高度化事業
研究期間　：2003〜2005年度
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