豚胚の凍結保存方法の検討及び移植試験

［要約］

豚胚のガラス化融解後の生存性向上を図るため、新たにガラス化前後の培養液にβＭＥ199を用いて、推定-135℃でガラス化し、40℃で融解、６ＳｔｅｐでＥＧ除去したところ、79.5％と良好な生存率を得た。この方法でガラス化融解した胚を移植した結果、1頭が受胎して8頭の生存子豚を得た。

［背景・ねらい］

ガラス化保存した豚胚移植による受胎・分娩例は未だ少なく、その手法については改良の必要性がある。本試験は融解後の胚の生存性向上と移植による受胎・分娩を目指して、ガラス化前後の培養液、ガラス化温度、融解温度、凍結保護物質の除去方法を検討した。

［成果の内容・特徴］

1. 妊娠６日目の供胚豚から外科的に採取した拡張胚盤胞〜脱殻胚盤胞を用いて、愛知県の小林らの方法に従い、2Ｍエチレングリコール（ＥＧ）液中で5分間平衡した後、0.25mlプラスチックストロー内のガラス化溶液（8ＭＥＧ＋7％ポリビニールピロリドン液）　層に移してからガラス化保存した。
2. ガラス化前後の胚の培養には、ｍＣＺＢ及び新たに抗脂肪酸化作用のある0.1mＭβメルカプトエタノールと10％牛胎仔血清を添加したＴＣＭ199（βＭＥ199）を用いた。
3. ガラス化は、ストローを液体窒素（-196℃）に直接浸ける方法及び新たにストロー暴発防止と凍結時のフラクチャー傷害防止を図るために液体窒素蒸気中（液面から1cmの発泡スチロール上、推定-135℃）で3分間保持する方法で行った。
4. 胚の融解は、室温(20〜25℃）で5秒間保持してから25℃温水中で10秒間浸す方法及び　新たに融解速度を速めて融解後の生存性を向上させるため、室温5秒間保持後、40℃の温　水中で5〜6秒間浸す方法で行った。
5. ＥＧの除去はストロー内でガラス化溶液と1.7Ｍガラクトース液と混和した（第１段階　希釈）後、1Ｍ、0.5Ｍ、0ＭのＥＧ液（ＰＢＳ）に2分間ずつ感作させる４Ｓｔｅｐ法及　び新たにＥＧ除去をより促す目的で第１段階希釈後、1Ｍ、0.5Ｍ、0.25Ｍ、0.125Ｍ、0　ＭのＥＧ液に3分間ずつ感作させる６Ｓｔｅｐ法で行った。
6. 融解後24時間の胚生存率は、培養液にｍＣＺＢを用い、-196℃でガラス化、25℃で融解、４ＳｔｅｐでＥＧ除去した方法（対照）で43.5％であった。一方、新たに培養液にβＭＥ199を用い、推定-135℃でガラス化、40℃で融解、６ＳｔｅｐでＥＧ除去した方法では79.5％と対照より有意に高かった。（表１）
7. 対照の方法でガラス化融解した胚19.3±0.6個を受胚豚3頭に、35.0±2.8個を2頭に移　植したが受胎しなかった。一方、新たな方法でガラス化融解した胚39.0±5.7個を受胚豚2頭に移植したところ、1頭が受胎に至り8頭の生存子豚を分娩した。（表２）

［成果の活用面・留意点］

1. 培養液、ガラス化温度、融解温度、凍結保護物質の除去方法について、新たな手法を　組み合わせて豚胚をガラス化融解することにより、融解後24時間の胚生存率を改善し、受胎分娩例を得ることができた。本試験では、どの項目が有効なのか不明のため、今後　明らかにする必要がある。
2. 48時間後の胚生存率は供胚豚による個体差が大きく、新たな手法を用いてもこの個体　差を改善するには至らなかった。

［具体的データ］

［その他］