キュウリ黄化えそ病ウイルスのRT-LAMP法を用いた高感度かつ簡易な検出法

RT-LAMP法を用ることで、キュウリ黄化えそ病ウイルス（MYSV）をELISA法及びRT-PCR法より高感度かつ簡易に検出できる。

  群馬県内の施設栽培キュウリにおいて、Melon Yellow Spot Virus （MYSV)によるキュウリ黄化えそ病の発生が問題となっている。県内の平坦地を中心に発生面積が増加しているため、現地では迅速な診断による防除対策が求められている。そこで、RT-LAMP（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法を用いた現場で活用できる高感度で簡易な検出法を開発する。

１．	MYSV検出用LAMPプライマーは、データベースに登録されたMYSV分離株の遺伝子配列情報を基に、LAMP法プライマー設計支援ソフト「PrimerExplorer Ver.3(富士通）」を用いて作成した（表１）。
２．	キュウリのMYSV感染葉から抽出した全RNAを対象とした場合、上記プライマーを用いたRT-LAMP法は、RT-PCR法と比較して、検出感度が100倍高い（図１）。
３．	植物磨砕液をそのまま用いた場合でも、RT-LAMP法はMYSVの検出が可能であり、ELISA法と比較して10〜100倍の高い検出感度である（図２）。

１．	検出感度が高いため、試料のコンタミネーションによって、擬陽性を示しやすいので、試料調製時の操作には注意する。
２．	RT-LAMP法で処理した検体は、電気泳動を行わなくとも蛍光・目視検出試薬を添加することで、紫外線下での発光反応（図２）及び可視光線下で緑色への呈色反応（図略）により、目視でMYSVを容易に検出できる。
３．	RT-LAMP法は、一定温度（65℃付近）に保温することで反応が進むため、PCR装置等の特別な機器は必要なく、恒温器1台があれば実施可能である。
４．	操作に要する時間は、RT-PCR法で５時間程度、ELISA法で７時間程度であるのに対し、RT-LAMP法は１時間程度で済み、現場で迅速に検定できる。
５．	RT-LAMP法を用いた診断を営利目的で行う場合は、栄研化学株式会社に対し、本法に関する特許の実施許諾契約が必要となる。

［具体的データ］

研究課題名：RT-LAMP法を用いたMelon Yellow Spot Virus （MYSV）の簡易検出法の開発
予算区分：県単
研究期間：2006年度
研究担当者：桑原克也