定量PCR法によるダイズ葉焼病菌のダイズ種子からの検出・定量

ダイズ葉焼病菌のrpoD遺伝子を特異的に増幅するプライマーとプローブを用いて定量 PCRを行うと、ダイズ種子中に存在する本菌の有無を検出し、汚染種子の割合を定量できる。

福井県では、ダイズ葉焼病の発生が増加傾向にある。本病は、種子伝染すると考えられているが、種子中のダイズ葉焼病菌（Xanthomonas axonopodis pv. glycines ）を特異的に検出・定量する方法は報告されていない。そこで、本病の汚染種子の割合を診断できる定量PCR （qPCR）法を確立し、防除対策に資する。

１．	ダイズ葉焼病菌のハウスキーピング遺伝子であるrpoD遺伝子の塩基配列をもとに設計したプライマー（X. C. glycines-F、X. C. glycines-R）およびプローブ（X. C. glycines-Probe）を用いてqPCRを行うと、本菌DNAの増幅は認められるが、近縁なXanthomonas 属細菌9菌株からは増幅されない（図１）。
２．	本qPCR法では、福井県内で採集したダイズ葉焼病菌60菌株のDNAは増幅するが、圃場で栽培したダイズ葉から分離した細菌30菌株のDNAは増幅しない（データ省略）。
３．	粉砕した健全種子にダイズ葉焼病菌の10倍希釈菌液を添加後、DNAを抽出しqPCRを行うと、6×102〜6×108cfu/gの範囲で定量できる再現性の高い検量線が得られる（表１、図２）。
４．	健全種子に対して、汚染種子を5，25，50，75，100％の割合で混合した材料を用いてDNAを抽出しqPCRを行った結果、汚染種子の割合と本菌の定量値との相関が高いことが示される（図３）。このため本qPCR法は、種子の汚染割合を診断するために利用できる。

１．	本qPCR法によるダイズ種子の保菌の有無や程度の判別により、健全種子の確保・供給のための基礎資料として活用できる。

研究課題名：ダイズ葉焼病の診断技術と被害防止技術の確立
予算区分：地域科学技術振興事業
研究期間：2008〜2010年度
研究担当者：渡辺貴弘、澤田宏之（生物研