食品機能性マニュアル

・がん予防機能評価法

　　アポトーシスは遺伝子によって制御された能動的な細胞死である。アポ
　トーシスが起こると、核クロマチンの凝縮、核の断片化、細胞の断片化及
　びアポトーシス小体の形成が見られ、生じたアポトーシス小体は他の細胞
　に貧食されて除去されることが知られている1)。がん細胞に、このような
　アポトーシスを誘導することによって、がんの抑制効果が期待できる。殆
　どの場合において、アポトーシスは、ヌクレオソーム単位でのDNAの断片化
　を伴うことが報告されている1)。

準備
【器具】
　15mlディスポーザブルチューブ　　　　　6well培養プレート
　マイクロピペット(滅菌チップ)　　　　　血球計算盤
　倒立型顕微鏡　　　　　　　　　　　　　スライドグラス
　カバーグラス　　　　　　　　　　　　　蛍光顕微鏡
　恒温水槽　　　　　　　　　　　　　　　振とう機
　試験管ミキサー　　　　　　　　　　　　マイクロチューブ
　マイクロ冷却遠心機　　　　　　　　　　パスツールピペツト
　遠心式濃縮器　　　　　　　　　　　　　電気泳動装置
　電気泳動用電源　　　　　　　　　　　　UVトランスイルミネ一夕ー
　ポラロイドカメラ(または、CCDカメラ)

【細胞、培地、試薬】
　1. アポトーシス誘導能の測定法
　　1-1. 細胞
　　　　HL60細胞はヒューマンサイエンス研究支資源バンク(TEL：
　　　06-945-2869，FAX：06-945-2872)及び理研ジーンバンク(TEL：
　　　048-462-1111，FAX：048-462-4609)より入手できる。
　　1-2. 培地
　　　　RPMI1640培地。10%ウシ胎児血清を加えて培養する。
　　1-3. 血清
　　　　ウシ胎児血清。ロットチェックして異常のみられないもの。水浴
　　　中、57℃で30分間インキュベーションし、非動化してから用いる。
　　1-4. DMSO(dimethylsulfoxide)あるいはエタノール
　　1-5. PBS(-)(滅菌)

　2. 蛍光染色によるアポトーシス細胞の観察
　　2-1. 細胞固定液
　　　　１%グルタルアルデヒドin PBS
　　2-2. 蛍光染色液
　　　　1mMヘキスト33258 in PBS

　3. DNA断片化の解析法
　　3-1. 抽出Buffer
　　　　O.5%SDS、100mMEDTAを含む50mMms-HClbuffer,pH8.0
　　3-2. RNase溶液
　　　　RNase(Sigma)10mgを1mlの蒸留水に溶解し、－20℃に保存する。
　　3-3. Proteimse K溶液
　　　　Proteimse K(Sigma)10mgを1mlの蒸留水に溶解し、－20℃に保存する。
　　3-4. TE飽和Pheno1
　　　　遺伝子工学研究用(ニッポンジーン)
　　3-5. エタノール
　　　　－20℃に保存しておく。
　　3-6. TE buffer
　　　　lmM EDTAを含む10mM Tris-HCl buffer, pH8.0
　　3-7. TBE buffer
　　　　89mM Boric acid、2mM EDTAを含む89mM Tris-HCl buffer, pH8.0
　　3-8. 2%アガロースゲル
　　3-8-1. 2%アガロースになるように三角フラスコにアガロースを量り取
　　　　り、0.5%TBEを加えて懸濁する。
　　3-8-2. オートクレーブで110℃、10分間でアガロースを溶解する。
　　3-8-3. キャスティングトレーの両端をオートクレーブテープで止め、
　　　　コームをセットする。
　　3-8-4. アガロース溶液が60℃以下に冷えたら、EtBr(Ethidium bromide、
　　　　遺伝子工学用、(ニッポンジーン)を1/20000になるように添加し
　　　　た後、トレーに流し込む。
　　3-8-5. アガロースが固まったら、テープを除き、泳動漕にセットする。
　　3-9. BPB溶液
　　　　bromophenol blue(BPB)1mg、グリセリン0.1ml吸び蒸留水0.9mlを
　　　　混和する。

操作の実際
　1. アポトーシス誘導能の測定法2)
　　1-1. 細胞(HL60細胞等)を6wellプレートに1-2x10 5 cells/mlになるよ
　　　うに播種する。
　　1-2. アポトーシス誘導能を測定するサンプルは少量のDMSOあるいはエ
　　　タノールに溶解する。
　　1-3. 各wellにサンプルを添加し、C02インキュベーター内、95%湿度、
　　　37℃の条件下で6～24時間培養する。
　　1-4. 各wellの細胞浮遊液を15mlのチューブに入れ、約1200～1500rpm
　　　で遠心して、細胞を回収する。
　　1-5. 回収した細胞について、蛍光染色してクロマチンの凝縮及び核の
　　　断片化を観察する。また、電気泳動法によりDNAの断片化を解析する。

　2. 蛍光染色によるアポトーシス細胞の観察3)
　　2-1. 回収した細胞に細胞固定液100μlを加えて、ピペッティングによ
　　　り静かに細胞を攪拌する。
　　2-2. 室温で30分間、インキュベーションする。
　　2-3. 遠心して細胞を回収し、上清を除去する。
　　2-3. PBSを加えて、ピペッティングにより攪拌、遠心して、細胞を洗
　　　浄する。
　　2-4. 上清を除去した後、PBS 20μlを加えて、静に攪拌する。
　　2-5. 染色液(ヘキスト33258) 4μlを加えて、静に攪拌する。
　　2-6. スライドグラス上に細胞液、カバーグラスをのせ、蛍光顕微鏡下
　　　で観察する。

　3. DNA断片化の解析法4)
　DNAの抽出
　　3-1. 回収した細胞に抽出Buffer 1mlを加えて、溶解する。
　　3-2. RNase 5μlを添加し、370Cで30分間、インキュベーションする。
　　3-3. Proteinase K 10μ1を添加し、さらに、37℃で30分間、インキュ
　　　　ベーションする。
　　3-4. TE 飽和 Phenol 1mlを加え、30分間ゆっくり攪拌する。
　　3-5. 2500rpmで15分間、遠心する。
　　3-6. 上清を15mlチューブに移し、-20℃に冷やしたエタノール2.5ml
　　　　を加える。
　　3-7. 4℃で30分間、インキュベーションする。
　　3-8. 4℃、2500rpmで15分間、遠心する。
　　3-9. パスツールピペットで上清を除去する。
　　3-10. 遠心濃縮機等で、15～30分間乾燥する。
　　3-11. TE buffer 100μlに溶解して、電気泳動用DNAサンプルとする。

　電気泳動
　　3-12. 2%アガロースゲルを作成し、泳動槽にゲル全体が浸るまでTBE
　　　　 bufferを入れる。
　　3-13. マイクロチューブにDNAサンプル10μl及びBPB溶液2μlを入れ、
　　　　ミキサーでよく攪拌し、遠心してチューブの底にサンプルを集め
　　　　ておく。
　　3-14. ゲルのコームをぬき、マイクロピペットでwellにサンプルを流
　　　　し込む。
　　3-15. 40～60V程度で泳動する。
　　3-16.ゲルをUVトランスイルミネーター上で観察し、ポラロイドカメラ
　　　　で撮影する。あるいはCCDカメラでコンピュータ上に画像を取り込む。

参考文献
　1) 田沼靖一：アポトーシス実験プロトコール、青木一正、内海文彰、
　　丸太英晴編(秀潤社)pp.12-25 (1994)
　2) Kobori,M, Shinmoto,H., Tsushida,T. and Shinohara,K.：Cancer
　　 Lett., l19, 207-212 (1997)
　3) 塩川大介：アポトーシス実験プロトコール、青木一正、内海文彰、
　　丸太英晴編(秀潤社)、96-97(1994)
　4) 天貝美江子､塩川大介ら：アポトーシス実験プロトコール、青木一正、
　　内海文彰、丸太英晴編(秀潤社)、132-142 (1994)
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(小堀真珠子)
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