既存の硝化抑制剤とは異なる作用機作を持つ硝化阻害剤フェニルヒドラジンの硝化抑制効果とその評価

要約

アンモニア酸化細菌のヒドロキシルアミンデヒドロゲナーゼ阻害剤フェニルヒドラジンは、土壌において硝化抑制効果を示し、アンモニア酸化菌の増殖を阻害する。

  • キーワード:一酸化二窒素、硝化菌、硝化抑制剤、アンモニアモノオキシゲナーゼ、ヒドロキシルアミンデヒドロゲナーゼ
  • 担当:農業環境変動研究センター・物質循環研究領域・物質変換解析ユニット
  • 代表連絡先: niaes_manual@ml.affrc.go.jp
  • 分類:研究成果情報

背景・ねらい

農耕地から発生する一酸化二窒素(N2O)の主要な発生源の一つはアンモニア酸化細菌である。したがって、アンモニア酸化細菌を制御することによりN2Oの発生を削減できる。これまで、窒素肥料の損失防止の目的で使用されてきた硝化抑制剤のN2O発生抑制効果について調査し、N2O発生削減における有効性を明らかにしてきた。開発された硝化抑制剤は、アンモニア酸化細菌のアンモニア酸化反応を担うアンモニアモノオキシゲナーゼ(AMO)を阻害する。
一方、近年タンパク質の構造に基づき阻害対象とする酵素に対して、より効果の高い化学物質をデザインする構造ベース創薬技術が開発され、この技術を利用して効果の高い硝化抑制剤の開発が可能である。しかし、AMOは精製が困難なため酵素タンパクの構造に関する情報が極めて少ない。これに対しアンモニア酸化反応を担うもう一つの酵素ヒドロキシルアミンデヒドロゲナーゼ(HAO)は詳細な構造が明らかにされており、構造ベース創薬によるHAO阻害剤の開発が可能である。しかし、土壌におけるHAO阻害剤の硝化抑制効果に関する知見は極めて乏しい。そこでHAOをターゲットにした構造ベース硝化抑制剤開発のために、硝化菌に対する既知のHAO阻害剤の土壌中における硝化抑制効果を明らかにし、HAO阻害剤の硝化抑制効果を評価する。

成果の内容・特徴

  • 既知のHAO阻害剤フェニルヒドラジン(PHH)とAMO阻害剤として広く使用されているジシアンジアミド(DCD)(図1)を土壌培養法で比較すると、PHH(添加量10μmole/g土壌)はDCD(添加量5μmole/g土壌)とほぼ同等の硝化抑制効果を持つ(図2)。
  • PHHとDCDが土壌中のアンモニア酸化細菌(AOB)とアンモニア酸化古細菌(AOA)の菌数に及ぼす影響のアンモニアモノオキシゲナーゼサブユニットA遺伝子(amoA)をターゲットした定量的PCR解析によると、両方の阻害剤によってAOBとAOAの増殖が阻害される(図3)。
  • 土壌のAOBとAOAのPCR増幅amoA断片の次世代シーケンサー解析によると、PHH、DCDともにAOAの群集構造へ影響はなく、AOBの群集構造に及ぼす影響は限定的である。
  • 以上の結果からHAO阻害剤は硝化抑制剤として有効であり、その硝化抑制効果は土壌培養法とamoAを指標とした定量PCRおよび次世代シーケンサーによるアンモニア酸化菌の群集構造解析により評価できる。

成果の活用面・留意点

  • 土壌におけるHAO阻害剤の硝化抑制効果を示し、amoAを指標したHAO阻害剤の評価実験系を構築したことにより、これらの知見を活用した構造ベースの新規なHAO阻害型硝化抑制剤の開発が可能となる。一方、HAOを持たないAOAにも作用したことからAOA増殖阻害剤としての性質を検討する必要がある。

具体的データ

図1 ジシアンジアミド(DCD)とフェニルヒドラジン(PHH)が阻害する酵素反応;図2 フェニルヒドラジン(10mmole/g土壌)とジシアンジアミド(5mmole/g土壌)の硝化への影響;図3 フェニルヒドラジンとジシアンジアミドのアンモニア酸化細菌(AOB)の増殖への影響

その他

  • 予算区分:交付金、競争的資金(農食事業、科研費)
  • 研究期間:2014~2017年度
  • 研究担当者:楊文杰(淮陰師範学院)、王勇、多胡香奈子、徳田進一、早津雅仁
  • 発表論文等:Yang W. et al. (2017) Front. Microbiol. 8:2226 doi:10.3389/fmicb.2017.02226