立体構造を保持した組換えプリオン蛋白質の高純度精製法の開発

要約

温和な条件下における三段階の精製法により、立体構造を保持したバキュロウイルス由来組換えプリオン蛋白質の高純度精製が可能になる。精製した組換えプリオン蛋白質は異常型への構造変換能を有する。

プリオン蛋白質の構造解析や分子間相互作用解析、抗体の作製等を行うためには、立体構造を保持した高純度なプリオン蛋白質が必要である。本研究では、温和な条件下で行う三段階からなる精製方法を開発し、異常型への構造変換能を保持したバキュロウイルス由来組換えプリオン蛋白質の高純度精製を目指す。

プリオン蛋白質のN末端側に、ヒスチジンタグおよびプロテアーゼ感受性タグを付加したプリオン蛋白質遺伝子を設計する。
上記遺伝子をバキュロウイルスベクターに組み込み、昆虫細胞で組換えプリオン蛋白質を発現させる。
第一段階は、金属イオンを固定化したカラムに吸着したヒスチジンタグおよびプロテアーゼ感受性タグ付組み換えプリオン蛋白質を選別する。第二段階は、プロテアーゼ処理により、プリオン蛋白質のみを溶出させる。第三段階は、プリオン蛋白質のN末端領域と結合するカラムを用いて精製する(図1)。
精製後の組換えプリオン蛋白質の純度は約95%である(図2)。
精製後の組換えプリオン蛋白質は、試験管内増幅法(PMCA法)により異常型に構造変換されることから、正しい立体構造を維持していると考えられる(図3)。

図1 三段階アフィニティー精製法?図2 精製組換えプリオン蛋白質の電気泳動像?図3 異常型プリオン蛋白質への構造変換