情報：農業と環境　Ｎｏ．７８　(2006.10)
独立行政法人農業環境技術研究所

１．微生物多様性評価のための土壌からの環境ＤＮＡ抽出法の開発

土壌や水など環境中に存在する培養困難な微生物を調べるためには、環境中から直接ＤＮＡを抽出して解析する手法が用いられます。

日本の畑地面積の大部分を占める黒ボク土はＤＮＡを強く吸着するため、ＤＮＡの抽出は困難でしたが、スキムミルクを抽出液に添加することによりＤＮＡの抽出が可能になりました （図１）。

２．環境ＤＮＡで土壌くん蒸処理の微生物影響をみる

環境生物のなかで、微生物は物質循環など生態系で基礎となる重要な役割を果たしています。畑土壌生物多様性ＲＰではスキムミルクを用いた土壌からのＤＮＡ抽出法を用いて、病害虫防除のための土壌くん蒸剤が防除対象外の土壌微生物に与える影響について、評価を行いました。抽出したＤＮＡをＰＣＲで増幅し、変性剤勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法で解析しました。その結果、土壌くん蒸剤 （クロルピクリン） の処理により土壌微生物の多様性は大きく減少することが明らかになりました （図２）。一方、殺線虫剤（Ｄ−Ｄ）の処理の影響は少なく、また、無処理区にはない細菌ＤＮＡのバンドが増大しました （図３中央）。このように、Ｄ−Ｄにおいても処理を繰り返すことにより微生物相に影響が現れることが明らかになりました。

さらに、これらのバンドの塩基配列を調べることで、存在する微生物の分類群を推定することができます。たとえば、細菌相についての解析では、無処理土壌のＤＮＡバンド （図３左） には、培養できない未知の細菌と推定される細菌ＤＮＡのバンドが検出されました。しかし、クロルピクリン処理の土壌では、これらのバンドは消失し、培養可能な細菌と推定されるバンド（図３右）が増大・出現しました。このことは、この手法によれば、従来の培養法では評価できなかった培養困難な微生物を含めて、薬剤処理が及ぼす影響を解析できることを示しています。

このように、土壌から直接抽出した環境ＤＮＡを用いる解析法は、農業現場における土壌微生物相の変化をとらえることができるので、農薬、肥料、有機物等の施用が環境に及ぼす影響評価に利用できると期待されます。

３．土壌線虫を指標とした黒ボク土畑における耕起の影響評価

かく乱の程度が異なる不耕起栽培畑と慣行栽培畑を用いて、土壌線虫を指標生物として、耕起というかく乱の影響を比較、評価しました。その結果、３つの方法で計算した多様度指数は、いずれも不耕起栽培の方が慣行栽培より高いことが明らかになりました。このように土壌線虫を指標として耕起などの農耕地かく乱の生物多様性に対する影響を評価できることが判明しました。