新規プライマーを用いたLAMP法による牛ヨーネ菌検出

［要約］

［キーワード］

ウシ、LAMP、ヨーネ病、診断、糞便、遺伝子、検査

［担当］道立畜試・基盤研究部・遺伝子工学科、栄研化学(株)・生物化学研究所　
［代表連絡先］電話0156-64-5321
［区分］北海道農業・畜産草地
［分類］技術・参考

［背景・ねらい］

北海道における牛ヨーネ病患畜は2006年に555頭、2007年には７月の時点で422頭と減少傾向がみられない。畜産試験場は2004年１月に国産の遺伝子増幅技術であるLAMP法を用いた牛糞便からのヨーネ菌遺伝子検出法を開発したが、検出感度が0.05pg/testと低く、また検出時間が90分間と長いため、改良が必要である。そこで、本試験では、新たにLAMP用プライマーを作製し、LAMP法の検出感度向上および反応時間短縮を目指す。

［成果の内容・特徴］

新たに設計したプライマーF17によるLAMP法は、40分間のLAMP反応によりヨーネ菌DNA0.005pg/testを検出し、リアルタイムPCR法と同程度の検出感度である（図１）。また、高濃度のヨーネ菌類似菌DNAは50分以降に増幅するが、想定している判定時間以降の増幅で識別可能であり、プライマーダイマーに起因する非特異増幅は120分間までは生じない。
ヨーネ菌が含まれていない糞便試料（陰性糞便試料）10試料から調製したDNA試料においてLAMP法による増幅反応はみられない。
患畜糞便58試料のうち糞便培養法陽性の16試料すべてにおいてLAMP法によりヨーネ菌DNAを検出する（表１）。
培養スコアが大きくなるとLAMP法のTt値（LAMP反応において濁度0.1に達した時間）が小さくなる傾向がみられる（図２）。
LAMP法の検出結果は、リアルタイムPCR法の検出結果と93.1％一致し（表２）、またLAMP法のTt値とリアルタイムPCR法のCt値（リアルタイムPCR法において一定の増幅産物に達するサイクル数）に相関（γ＝.736）がある（図３）。
ヨーネ病発生農家の牛群から採取した糞便試料において、糞便培養法陽性９試料のうちLAMP法により検出できたのは３試料である。糞便培養法において確認されたコロニー数が少ない試料において、LAMP法およびリアルタイムPCR法で検出されないものもあるが、LAMP法の検出結果はリアルタイムPCR法の検出結果と96.8％一致する。

［成果の活用面・留意点］

ヨーネ菌用培地上に形成したコロニーのヨーネ菌同定に活用できる。
本検査法は、国の「牛のヨーネ病防疫対策要領」および北海道の「牛のヨーネ病防疫対策実施要領」において、牛ヨーネ病の検査法に規定されておらず、現段階では、診断に利用できない。
LAMP試薬キットを2008年度発売予定。

平成19年度北海道農業試験会議（成績会議）における課題名および区分
「LAMP法による牛ヨーネ菌検出」（研究参考）

［具体的データ］

［その他］

目次へ戻る