RNA抽出

RNA抽出
メニュー
(1)原理と種類
(2)準備
(3)実際の手順
(4)注意点
(1) 原理 と種類
RNA はDNAと比較してきわめて不安定なため、必ず手袋をして、素早く操作を行ってください。抽出した後のRNAは必ず冷凍(-80℃または-20℃)してください。RNAを分解する酵素(RNase)はどこにでも存在するので、試薬から自分でRNaseを除くのは面倒です。RNAの抽出はキットをお勧めします。RNA抽出キットは、大きく有機溶媒を用いるもの(ISOGENなど)とカラムを用いるものに分けられます。どちらも十分な純度が得られますので、環境(有機溶媒をつかえるかどうか)やコストにより選択してください。
(2) 準備
様々なキットが市販されていますが、以下のものがお勧めです。
ISOGEN、TRI regent、TRIZOL(これらはフェノール及びチオシアン酸グアニジンを含む溶液でほとんど同じです)
MagExtractorTM -RNA(吸着性磁気ビーズを用いた精製キットです。幾つか種類があり、DNA用はRNAには使えないので注意してください)
カラムタイプ(RNeasyなど)も大丈夫ですが、多糖が多い試料ではカラムが詰まることがあるので、注意してください
その他の必要な試薬
エタノール (ethanol)
イソプロパノール (2-propanol)
滅菌脱イオン蒸留水
(マニュアル等にはDPEC処理水を推奨していますが、EPEC処理は体とRNAに悪影響があるので、通常のRT-PCRではこれで十分です)
器具
微量遠心機(可能なら冷却機能付)
マイクロチューブ
マイクロピペット(200μl〜1000μl用)
マイクロチップ(20μl〜 200μl用)
(古いマニュアル等にはチューブや器具のDPEC処理を推奨していますが、通常のRT-PCRでは不要です)
(3) 実際の手順
ここでは、フェノール及びチオシアン酸グアニジンによるRNAの抽出を紹介します。
フェノールやクロロホルムが使用可能な環境では、日本 ジーンのISOGEN、シグマのTRI Reagent、ナカライのセパゾールが便利です。ここでは、日本 ジーンのISOGEN使った方法を紹介します(RI Reagent、セパゾールも全く同じ方法です)
1. 試料0.1gを乳鉢で磨砕する(堅い試料の場合は、液体窒素を使うか、乳鉢ごと-80℃で凍らせてから磨砕すると良い)
2. ISOGENを500μl添加し、マイクロチューブに入れる
3. 室温10 minまたは50℃で5分間加温する
4. クロロホルムを100μl加え、十分に混和する
5. 遠心分離15,000 rpm 5min
6. 上澄みを新しいチューブに移す
7. 等量のイソプロパノール(2-propanol)をl加え、15,000 rpm 15分間遠心分離 (室温放置は不要です)
8. 液を全て捨て、70%エタノールを100μl加える
9. 液を完全に除く
10.減圧乾燥(減圧乾燥器がない場合は、 10分間ふたを開けておいても良い)
11.-20℃で保存(RT-PCRを行う直前に蒸留水に溶解する)
(4) 注意点&FAQ
沈殿が見えない!
純度が高い試料ではRNAはほぼ透明になります。
虫体1頭からRNAを抽出する場合 など、量が非常に少ない場合、沈殿を得ることが難しくなります。このままでは損失が大きいので、沈殿(上の手順では7)の際にグリコーゲンを1μl加えてください。
沈殿が溶けない!
多量の多糖が残っている場合、沈殿が溶けにくくなります。溶けない場合は無視してかまいません。
RNAの保存法
RNAはDNAに比べ不安定なので、蒸留水に溶解した状態で室温に長く置くと分解します。
-20℃で保存すれば数ヶ月は保存できますが、長期保存は-80℃で行ってください。