体外受精におけるパーコールを用いた発生能の高いウシ卵子の選別

15%パーコール液に沈降し、20%パーコール液で沈降しないウシ卵子の体外受精での胚盤胞発生率は高い。

ウシ体外受精卵の胚盤胞発生率は体内由来受精卵より低いことから、体外受精卵生産技術の更なる改良が必要である。体外受精に供する卵丘細胞−卵子複合体（ＣＯＣ）の品質は形態学的に判断されているため、技術者の主観による影響を受ける。技術者の個人差なしに、品質が良く、ばらつきの少ないウシ卵子を確保することは効率的な技術改良のために有効である。
そこで、パーコール液への沈降速度の違いを利用して選別したＣＯＣの体外受精での胚盤胞発生率を明らかにし、発生能の高いウシ卵子を客観的に選別する方法を開発する。

１．	パーコール液によるＣＯＣの選別は、3mg/mlBSA（フラクション�X）と0.5単位/mlヘパリンを含むDPBSで、15％、20％、25％（V/V）パーコール液を作成し、４穴ディッシュに900μｌづつ入れ、ＣＯＣを15%パーコール液表面に静置し、３分間放置後、沈降したＣＯＣを回収し、より濃いパーコール液で同様の操作を繰り返すことにより行う。
２．	選別された卵子の平均直径は、15%パーコール液に沈降しないＣＯＣで大きく、20%パーコール液で沈降し、25％パーコール液に沈降しないＣＯＣで小さい（表１）が、胚盤胞発生率との関係は認められない（表２）。
３．	15％パーコール液に沈降しないＣＯＣは体外受精での、分割率、胚盤胞発生率ともに低い（表２）。
４．	15％パーコール液に沈降し、20％パーコール液に沈降しないＣＯＣは体外受精での、分割率、胚盤胞発生率が高い（表２）。
５．	胚盤胞発生率の高いＣＯＣは形態的に卵丘細胞の層がやや薄く、卵丘細胞間の結合がやや緩い特徴を持つ（図１-区分２）。

１．	実際の体外受精への利用では、15%パーコール液に沈降し、20%パーコール液で沈降しないＣＯＣを回収する。
２．	当該技術を用いることにより、技術者の熟練度による差なしに、発生能の高いウシ卵子を選別できる。
３．	ＣＯＣは、卵丘細胞層が２層以上でかつ卵丘細胞層の完全な膨化や変性細胞塊の付着がないものを用いる。
４．	本成績は、体外成熟培地、体外受精媒精液には市販無血清培地を用い、成熟培養時間22時間、媒精時間６時間、発生培地として修正合成卵管液を用いる条件において得られている。

研究課題名：受胎率向上に向けた牛受精卵の品質判定技術の確立試験
予算区分：県単
研究期間：2007〜2009年度
研究担当者：四ツ島賢二、沖村朋子、廣瀬富雄