RT-PCRによるフリージアのインゲンマメ黄斑モザイクウイルスの検出

フリージア（Freesia spp.）の葉からRNAを抽出し、RT-PCRを行うことにより、フリージアの栽培で問題となるインゲンマメ黄斑モザイクウイルス(BYMV)を感度良く検出することができる。

フリージアの栽培では、ウイルス感染による品質・収量の低下が問題となっている。特に、インゲンマメ黄斑モザイクウイルス(BYMV)による被害が大きく、ウイルスフリー球の増殖・供給が求められている。そこで、既知のBYMVコートタンパク遺伝子の塩基配列情報を基に、ウイルス検出用のプライマーを設計し、RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）を用いたウイルスの検出を試みる。

１．	既知のBYMVコートタンパク遺伝子の塩基配列情報（グラジオラスから単離された系統の配列を含む６種）を基に設計したBYMV特異的プライマー「BYMV-CP54」と「BYMV-CP32」を用いる（表１）。
２．	表１に示すプライマーを用いてRT-PCRを行うと、BYMVに感染したフリージアでは、既知のBYMV塩基配列から想定されるサイズ（約480bp）と同じ大きさの増幅バンドが検出される（図１）。
３．	フリージアの葉からRNAを抽出し、RT-PCRを行った場合は、BYMV由来の増幅バンドを検出できるが、同一個体でも球茎や花弁を用いた場合は、バンドの検出が困難である（図１）。
４．	葉にモザイク、えそ、萎縮等の病徴が認められる個体では、RT-PCRによりBYMVが検出される。また、無病徴の個体でも、BYMVが検出される場合があるので、症状の有無だけでウイルス感染を判定することはできない（図１、表２）。
５．	培養植物の葉を用いた場合でもBYMVを検出することができる（表３）。

１．	RNeasy Plant Mini Kit（QIAGEN社）を用いて葉からRNAを抽出し、SUPER SCRIPT ONE-STEP RT-PCR System（Invitrogen社）を使用してRT-PCR（逆転写条件：50℃30分-94℃２分、PCR条件：94℃30秒-55℃30秒-72℃２分を40サイクル）を行う。
２．	潜在感染ウイルスも検出することができるので、育成系統や品種の種苗管理に活用できる。
３．	培養容器中の植物体の葉でもBYMVを検出できるので、茎頂培養によってウイルスフリー化した個体を初期に判別できる。

研究課題名：フリージアのウイルス診断技術の開発
予算区分：県単
研究期間：2001〜2006年度
研究担当者：吉秋斎、村濱稔、�M絵里子、小牧正子