サツマイモ体内からのエンドファイト窒素固定遺伝子の検出

要約

サツマイモに内生する窒素固定細菌のnifH 遺伝子を、PCRを用いて検出することができる。サツマイモ体内には、多様な窒素固定細菌が存在し、複数のnifH 遺伝子が機能している。

  • キーワード:サツマイモ、窒素固定、エンドファイト、nested PCR、ニトロゲナーゼ遺伝子(nifH)
  • 担当:中央農研・土壌肥料部・栄養診断研究室
  • 連絡先:電話029-838-8814、電子メールohwaki@affrc.go.jp
  • 区分:共通基盤・土壌肥料
  • 分類:科学・参考

背景・ねらい

近年、サトウキビやサツマイモなどの作物で、植物体内に生息する細菌(エンドファイト)による窒素固定が報告されている。これらの 作物からは、培養法により窒素固定細菌が分離されているが、培養が困難な細菌の存在も予想される。そこで、サツマイモから抽出したDNAおよびRNAよ り、PCRによりニトロゲナーゼ遺伝子(nifH )を検出する手法を確立する。また、その塩基配列情報からサツマイモに内生する窒素固定エンドファイトの菌種を推定する。

成果の内容・特徴

  • 窒素固定細菌のnifH 遺伝子を増幅するための、6種類のプライマーの塩基配列を図1に示す。
  • サツマイモ各器官をよく洗浄し、可能な器官については表皮部分を剥ぎ取り、さらに滅菌水で洗浄する。常法により DNAおよびRNAを抽出し、DNA、あるいはRNAの逆転写産物を鋳型としてPCR反応を行う。1回のPCRでは増幅した遺伝子断片が検出できないた め、2組のプライマーを用いたnested PCRを行う(図1)。初回のPCR反応は、上流のプライマーをnifH1またはnifH4とし、下流のプライマーをnifH2またはnifH3とする。2回目のPCR反応は、PolFとPolRの組合せとする。
  • 得られたPCR産物をアガロース電気泳動で分析することにより、約360塩基対の位置にnifH 遺伝子断片の増幅が確認できる(図2)。
  • 増幅したnifH 遺伝子断片の塩基配列をデーターベースと照合・解析することにより、菌種の推定ができる。サツマイモ体内にはRhizobium属、Herbaspirillum属、Anabaena属などに類似の窒素固定遺伝子が存在した(図3)。また、Bradyrhizobium属や未分離菌(uncultured bacterium)に類似したnifH 遺伝子が発現していた。

成果の活用面・留意点

  • サツマイモに内生する窒素固定細菌の地域間差や品種間差、窒素固定活性を示す部位や時期的変動などの基礎情報が得られる。
  • サンプルの採取および洗浄は最短時間で行い、液体窒素で凍結した後、-80度で保存する。
  • 微量な核酸を2回のPCRにより増幅するため、試薬や環境中からの窒素固定遺伝子の混入に注意する。コントロール反応を常に行い、コンタミネーションの有無を確認する。

具体的データ

図1 nifH遺伝子の増幅手順とプライマーの配列

 

図2 RT-PCRによるnifH遺伝子の増幅

 

図3サツマイモより増幅したnifH遺伝子の系統解析(近隣結合法)図中の学名は、データーベースより選んだnifH遺伝子

 

その他

  • 研究課題名:エンドファイト窒素固定評価技術の開発と最適窒素固定条件の解明
  • 課題ID:03-06-03-01-07-05
  • 予算区分:生物機能
  • 研究期間:2004∼2005年度
  • 研究担当者:大脇良成、寺門純子(日本学術振興会特別研究員)、山川博幹、田中福代、藤原伸介